CUT&Tag 技术新突破：可重现近半数 ENCODE ChIP-seq 组蛋白乙酰化峰

为解决 CUT&Tag（Cleavage Under Targets & Tagmentation）技术缺乏系统评估和基准测试的问题，研究人员开展了针对 H3K27ac 和 H3K27me3 的 CUT&Tag 技术与 ENCODE ChIP-seq 对比研究。结果显示 CUT&Tag 平均可重现 54% 已知 ENCODE 峰，该研究为 CUT&Tag 研究提供了基准框架。

　　在生命科学的探索旅程中，表观遗传学近年来备受瞩目，它宛如一把钥匙，为揭示人类疾病的潜在机制带来新希望。通过全基因组关联研究（GWAS）发现，大量人类疾病风险变异体定位在基因组的非编码区域，且这些区域似乎在基因调控区域富集。其中，组蛋白修饰在染色质动态变化和基因调控中扮演着关键角色，比如 H3K27ac 作为一种高度细胞特异性的组蛋白修饰，是活跃增强子和启动子的标志，与复杂疾病密切相关。然而，由于疾病和对照组织中缺乏表观基因组注释，以及现有资源多使用异质性器官的批量组织，掩盖了细胞类型特异性的调控景观，使得理解复杂人类疾病中表观遗传调控的精确机制以及将非编码变异与疾病表型联系起来困难重重。

一直以来，染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）是表观基因组分析的标准方法。但它存在信噪比低、表位被固定和交联掩盖、染色质超声处理导致异染色质偏差等问题，在处理低细胞数量样本时也面临挑战，且对单细胞应用适应性差。CUT&Tag 作为一种新兴技术，被认为是 ChIP-seq 的简化、可扩展且经济高效的替代方法，不过它缺乏针对现有数据集的系统优化和基准测试，实验建议和数据分析流程也未达成共识。

为了解决这些问题，来自英国帝国理工学院伦敦分校和伦敦国王学院的研究人员展开了深入研究。他们针对 H3K27ac 和 H3K27me3 这两种组蛋白修饰，对 CUT&Tag 技术进行了全面的实验优化和系统的基准测试，并将结果发表在《Nature Communications》上。这一研究为未来 CUT&Tag 研究的设计和分析提供了重要的指导框架，意义重大。

研究人员开展此项研究时，运用了多种关键技术方法。在样本处理方面，使用人类 K562 细胞进行实验，通过一系列步骤制备 CUT&Tag 文库。测序上，采用 Illumina 测序技术对文库进行测序。数据分析上，运用 TrimGalore、bowtie、Picard、samtools、bedtools 等工具处理数据，使用 MACS2 和 SEACR 进行峰调用，还借助多种 R 包进行下游分析。

研究结果如下：

• 实验设计与优化：研究人员在 K562 细胞中对 H3K27ac 和 H3K27me3 进行 CUT&Tag 实验，生成了 38 个新的测序数据集。针对 H3K27ac CUT&Tag，测试了多种抗体来源、稀释度、PCR 循环数、DNA 提取方法和组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACi）。经 qPCR 验证后，选取部分抗体进行测序。结果发现，添加 HDACi（如曲古抑菌素 A（TSA）和丁酸钠（NaB））并未提高数据质量和 ENCODE 覆盖度；减少 PCR 循环数和采用 SDS - 基于的 DNA 提取方法，能在一定程度上优化实验结果，最终确定 15 个 PCR 循环、SDS - 基于的 DNA 提取且不添加 HDACi 的实验条件用于后续基准测试。
• 数据质量控制：对表现最佳的抗体生成低重复率的测序数据集进行质量控制。分析片段长度发现，CUT&Tag 片段大小与人类细胞核中的相似，且存在约 180bp 的片段，反映单个核小体的 DNA 长度。计算 FRiPs（Fractions of reads in peaks）评估信噪比质量，结果显示 H3K27ac CUT&Tag 样本峰的 FRiP 分数与 ENCODE 相当，H3K27me3 CUT&Tag 样本峰的 FRiP 分数优于 ENCODE。此外，CUT&Tag 对相应组蛋白修饰峰的特异性较高，但 H3K27ac CUT&Tag 会产生更多与某些 ENCODE H3K27me3 位置对齐的残留读数。同时，研究还发现 CUT&Tag 和其他基于 Tn5 转座酶的方法可能存在开放染色质偏好，几乎所有 H3K27ac 区域都与开放染色质区域重叠。
• 峰调用分析：评估不同峰调用方法，发现 SEACR 和 MACS2 在不同参数设置下表现各异。基于精度和召回率分析，确定了两者的最佳参数。SEACR 在高重复率下更稳健，而 MACS2 与 ENCODE 峰的相似性更高。总体而言，两者识别的 CUT&Tag 峰在 ENCODE 召回率上相近，约为 50%，且都能捕获高信号强度的峰，遗漏部分低强度峰。
• 与 ENCODE ChIP-seq 的基准测试：将 CUT&Tag 与 ENCODE ChIP-seq 进行基准测试，发现限制分析区域到相应标记的峰区域时，两者的相关性显著增强。CUT&Tag 对 ENCODE 峰的平均召回率为 54%，不同样本和峰调用方法下有所差异。CUT&Tag 捕获的是最显著的 ENCODE 峰，且这些峰包含更多 ATAC-seq 读数。在较低测序深度下，部分 H3K27ac CUT&Tag 抗体（如 Diagenode）表现出比 ENCODE 更高的 FRiP 分数和更低的脱靶读数。
• 功能分析：对 CUT&Tag 峰进行功能分析，发现 H3K27ac CUT&Tag 峰强烈偏向启动子近端区域，与 ENCODE ChIP-seq 类似；H3K27me3 峰主要定位在异染色质和抑制染色质区域。基因本体富集分析表明，CUT&Tag 能恢复所有 ENCODE K562 H3K27ac ChIP-seq 的顶级本体术语。基序分析显示，CUT&Tag 检测到许多 ENCODE H3K27ac 未捕获的转录因子结合基序（TFBMs），与 K562 细胞系的特性相符。

研究结论和讨论部分指出，CUT&Tag 在研究 H3K27 组蛋白标记方面具有一定优势，能成功重现 ENCODE ChIP-seq 的许多特征，捕获最显著的峰，但只能恢复约一半的 ENCODE 峰。其性能可能因组蛋白标记而异，H3K27me3 的表现似乎优于 H3K27ac。高重复率可能导致 MACS2 检测到假阳性峰，应去除重复数据。峰调用设置对实验结果影响显著，未来需要更适合 CUT&Tag 数据的峰调用方法。尽管 CUT&Tag 存在局限性，但该研究的系统优化将有助于其在该领域更广泛地应用，加速对复杂疾病表观遗传病因和后果的理解，为生命科学和医学研究开辟新的道路，推动相关领域进一步发展。