HIV-1 包膜糖蛋白新发现：gp41 HR2 区关键残基调控对小分子抑制剂敏感性

这篇研究聚焦 HIV-1 包膜糖蛋白（Env）。CRF01_AE 毒株的 Env 在 375 位有组氨酸（H375），影响对小分子抑制剂的抗性。研究发现 gp41 HR2 区 629 位残基可调节 Env 稳定性及对两类小分子 gp120 抑制剂的敏感性，为理解 HIV-1 Env 耐药机制提供新视角。

　　

引言

HIV-1 包膜糖蛋白（Env）由三个 gp120 外膜亚基和三个 gp41 跨膜亚基组成三聚体，亚基间通过非共价相互作用连接。在病毒进入细胞过程中，Env 会发生一系列构象变化。当 gp120 与 CD4 受体结合后，会引发 Env 的构象改变，使其能够与 CCR5/CXCR4 共受体相互作用。随后，融合肽插入靶细胞膜，gp41 的 HR1 和 HR2 区域形成六螺旋束，驱动病毒与宿主细胞膜融合。

HIV-1 Env 处于不断进化中，这给有效 HIV 疫苗的开发带来巨大挑战，同时也导致了抗逆转录病毒药物耐药性的产生。尽管 Env 具有变异性，但 Phe43 腔等区域高度保守，Phe43 腔是 CD4 的苯丙氨酸 43 与 gp120 结合的位点，也是小分子 Env 抑制剂的作用靶点，如构象阻断剂 temsavir 和小分子 CD4 模拟物（CD4mcs）。

大多数已知的 HIV-1 毒株对进入抑制剂 temsavir 敏感，但 CRF01_AE 毒株除外。CRF01_AE 毒株起源于中非，1988 年在泰国首次出现后，在东南亚引发了疫情。该毒株对 temsavir 的抗性与 Phe43 腔 375 位的组氨酸残基（H375）有关。此前研究表明，375 位残基与 gp120 内层结构域的一些残基共同进化，影响 Env 对小分子进入抑制剂的敏感性。此外，研究还发现除了 gp120 内层结构域的残基外，还有其他氨基酸（如 341、430、519 和 629 位残基）与 375 位残基显著相关。本研究旨在评估这些残基是否会调节 Env 对具有相反活性的小分子 gp120 抑制剂（temsavir 和 BNM-III-170）的敏感性。

材料和方法

• 序列分析：使用 HIV 数据库的 Analyze Align 工具和 WebLogo 3 程序生成 HIV 的 Logo 图。分析基于 2024 年洛斯阿拉莫斯数据库整理的 Env 比对序列，包含 6,669 个 HIV-1 M 组氨基酸序列。氨基酸序列编号基于 HIV-1 原型 HXBc2 株。
• 细胞系：培养 HEK293T 人胚肾细胞、Cf2Th 犬胸腺细胞和 TZM-bl 细胞系，维持在 37°C、5% CO₂的条件下，培养基为添加 5% 胎牛血清和 100 U/mL 青霉素 / 链霉素的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）。Cf2Th-CD4/CCR5 细胞稳定表达人 CD4 和 CCR5，培养时需添加 G418 硫酸盐和潮霉素 B。TZM-bl 细胞是稳定表达高水平 CD4 和 CCR5 且含有受 HIV-1 长末端重复序列控制的荧光素酶基因的 HeLa 细胞系。
• 定点诱变：将单个或组合突变引入 CRF01_AE CM244 的不同 Env 表达质粒中，使用 QuikChange II XL 定点诱变方案，通过自动 DNA 测序确认突变。野生型（WT）CRF01_AE CM244 Env 包含 H375、A341、A430、I519 和 I629，对相关残基进行单独或组合突变，同时构建不同的突变体形式。
• 小分子 gp120 抑制剂：CD4 模拟化合物 BNM-III-170 按之前方法开发合成，temsavir 从 APExBIO 购买。将化合物溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，配制成 10 mM 的储存液，分装后储存在 - 80°C。
• 包膜糖蛋白的免疫沉淀：用标准磷酸钙方法转染 HEK293T 细胞，使其表达 CM244 gp160 WT 或突变体。转染一天后，用 [³⁵S] 甲硫氨酸 - 半胱氨酸对细胞进行代谢标记 16 h。收集细胞裂解物和培养基，用 HIV 感染者血浆混合物沉淀放射性标记的 CM244 包膜糖蛋白。计算突变体 gp120 与 Env 三聚体复合物的结合指数和加工指数，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影分析样品。
• 重组荧光素酶病毒：用磷酸钙转染法将 HIV-1 前病毒载体 pNL4.3 Env-Luc 和表达野生型或突变型 CM244 包膜糖蛋白的质粒共转染 293T 细胞，产生含有萤火虫荧光素酶基因的重组病毒。转染两天后收获细胞上清液，离心去除细胞碎片，测量逆转录酶活性，将病毒储存于 - 80°C。
• 细胞间融合：用磷酸钙方法共转染 293T 细胞，使其表达 HIV-1 Tat 和 CM244 野生型或突变型包膜糖蛋白。转染 48 h 后，将细胞与预先接种的 TZM-bl 靶细胞共孵育 6 h，裂解细胞后测量荧光素酶活性。
• 病毒中和试验：在感染前 24 h，将 Cf2Th-CD4/CCR5 靶细胞接种到 96 孔板中。将表达荧光素酶的重组病毒与不同浓度的 BNM-III-170 或 temsavir 孵育 1 h 后，加入到靶细胞中。孵育 48 h 后，裂解细胞并测量荧光素酶活性，计算中和半数抑制浓度（IC₅₀）。
• 冷灭活试验：制备含有野生型或突变型包膜的假病毒，冷冻保存。将 Cf2Th-CD4/CCR5 靶细胞接种到 96 孔板中，用在冰上孵育不同时间的病毒感染细胞。感染 48 h 后测量荧光素酶活性，计算灭活半数抑制时间（t_1/2）。
• 统计分析：使用 GraphPad Prism 9.4.1 软件进行统计分析，测试数据集的统计正态性，选择合适的统计检验方法，P 值小于 0.05 认为具有统计学意义。

结果

• HIV-1 各分支中 Phe43 腔及共进化残基的比较：HIV-1 分为 M、N、O、P 四个主要组，M 组病毒导致了全球大部分 HIV-1 流行，包含多种亚型和循环重组形式（CRFs）。在 M 组病毒中，gp120 Phe43 腔 375 位通常是丝氨酸，但 CRF01_AE 毒株中高度保守的是组氨酸（H375）。研究还发现 gp120 内层结构域的 6 个残基（61、105、108、474、475 和 476 位）与 375 位残基共进化，影响 Env 对多种抑制剂和抗体的敏感性。此外，A341、A430、I519 和 I629 位残基也与 375 位残基显著相关，但它们对 Env 对小分子进入抑制剂敏感性的调节作用尚不清楚。
• HR2 区 629 位残基调节 Env 对小分子 gp120 抑制剂的敏感性：为评估 A341、A430、I519 和 I629 位残基对 Env 敏感性的影响，将它们单独或与层突变（LM）组合引入 CRF01_AE Env_CM244中。结果显示，CRF01_AE WT 和 H375S 突变体对 temsavir 和 BNM-III-170 均耐药，而与 LM 突变组合（LMHS）后变得敏感。在 H375S 和 LMHS 背景下对相关残基进行突变，发现 341、430 和 519 位残基的突变对抑制剂敏感性无显著影响，而 I629M 突变使病毒对 BNM-III-170 的抗性增加约 5 倍，同时对 temsavir 的敏感性也增加约 5 倍。LMHS I629M 突变体在两种抑制剂中表现出相反的表型，因此被选作进一步分析。
• I629M 稳定 Env 三聚体：Env 构象会影响其对小分子抑制剂的敏感性，“封闭” 构象的 Env 更稳定，对构象阻断剂更敏感，“开放” 构象的 Env 对提前触发下游构象变化的分子更敏感。通过测量突变体 gp120 与 Env 三聚体复合物的结合能力发现，I629M 突变体的三聚体结合能力比野生型增加约 2 倍，病毒感染性也有所增加，但二者关系有待确定。I629M 突变对 Env 加工和细胞间融合能力无显著影响，但显著增加了病毒对冷灭活的抗性，表明 I629M 诱导 Env 发生变化，使其更稳定，从而增强了对 temsavir 的敏感性和对 CD4mc 的抗性。
• I629M 稳定 gp120 - gp41 的亚基间相互作用：利用实验室解析的 CRF01_AE T/F 100 SOSIP 三聚体结构，研究 I629M 突变对 Env 三聚体稳定性的影响。在 CRF01_AE T/F 100 野生型和 LMHS 无配体状态下的三聚体中，I629 与 gp120 的 V44 和 W45 形成疏水相互作用，LMHS 突变对该相互作用网络影响较小。temsavir 结合后，I629 与 V44/W45 的距离略有增加，I629 的埋藏表面积（BSA）减小。在 clade B 的 SOSIP 三聚体中，629 位为异亮氨酸（如 AMC009）时，I629 与 W45 的距离较长，与 V44 的接触较少，BSA 较小；而 629 位为甲硫氨酸（如 B41）时，M629 与 W45 的相互作用更广泛，BSA 更大。这表明 629 位的甲硫氨酸比异亮氨酸更能稳定 HIV-1 Env 中 gp120 - gp41 的亚基间接触。

讨论

HIV 包膜在病毒进入过程中会从 “封闭” 状态转变为 “开放” 状态。大多数流行的 HIV 毒株的 Env 倾向于保持 “封闭” 构象，而 CRF01_AE 毒株具有独特的结构动态。Phe43 腔 375 位的组氨酸使 CRF01_AE 毒株的 Env 更倾向于采样 “开放” 构象，导致其对非中和性 CD4 诱导（CD4i）抗体更敏感，同时对 CD4mc 抑制剂和构象阻断剂（如 temsavir）产生抗性。

进一步研究发现，除组氨酸外，gp120 层中的 6 个共进化残基协同调节 temsavir 抗性。对 M 亚型和 CRF01_AE 的序列分析发现了 CRF01_AE 独特的保守残基，但它们与 375 位残基的共进化关系及对 Env 识别的影响尚待确定。

功能研究表明，I629M 突变在调节对 CD4mc 的抗性、对冷灭活的抗性以及对构象阻断剂 temsavir 的敏感性方面起着关键作用。结构分析推测，I629M 通过增强 gp120 和 gp41 亚基之间的相互作用，维持更 “封闭” 的 Env 构象，从而影响两类小分子 Env 抑制剂的结合和功效。

本研究表明，HIV-1 gp41 中自然发生的 I629M 替代可导致更稳定的 Env 构象，可能通过维持包膜三聚体的完整性来提高病毒的整体适应性。由于 temsavir 已用于临床，本研究强调了监测潜在耐药突变的重要性，尤其是 gp41 中远离 gp120 结合位点的突变。