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本文聚焦伪狂犬病毒（PRV），发现其感染会抑制宿主细胞应激颗粒（SGs）形成，PRV 的即刻早期蛋白 IE180 通过与 G3BP1/2 相互作用并将其 “劫持” 入核来实现这一过程，揭示了 α 疱疹病毒抑制 SGs 形成的新机制，对探究病毒免疫逃逸意义重大。
引言
伪狂犬病（PR）由伪狂犬病毒（PRV）引起，PRV 属于疱疹病毒科，其基因组为双链线性 DNA。PRV 感染猪后会引发多种症状，严重危害全球养猪业。近年来，PRV 变异株不断出现，还出现了人感染 PRV 的病例。
当哺乳动物细胞受到包括病毒感染在内的多种环境应激时，会暂时抑制细胞蛋白质翻译，随后在细胞质中形成应激颗粒（SGs）。SGs 的形成一般通过真核翻译起始因子 eIF2α 的磷酸化来启动，Ras-GTP 酶激活蛋白结合蛋白（G3BP）和 T 细胞内抗原 1（TIA1）等特定的 SG 成核因子在 SG 组装中发挥重要作用，其中 G3BP 蛋白在驱动 SG 成核中至关重要。
病毒为了最大化自身复制效率并对抗宿主防御，会采取多种策略破坏 SG 聚集。例如，猪流行性腹泻病毒（PEDV）、非洲猪瘟病毒等会直接靶向 G3BPs 来抑制 SG 形成，仙台病毒、水泡性口炎病毒（VSV）则通过间接途径抑制 SG 形成。
IE180 是 PRV 的唯一即刻早期蛋白，与单纯疱疹病毒 1 型（HSV-1）的 ICP4 同源。虽然此前有研究探索了 IE180 的部分功能，但它在 PRV 感染期间对 SG 抑制和免疫逃逸的作用仍不明确。
结果
- PRV 感染抑制 SG 形成：为验证不同 PRV 毒株对 SG 形成的影响，研究人员用重组 PRV 毒株 PRV-EGFP 和经典疫苗株 BarthaK61 感染 PK-15 细胞，再用聚肌胞苷酸（poly (I:C)）或亚砷酸钠处理。结果显示，两种毒株感染均抑制了 SG 形成，而紫外线灭活的 PRV 则无法抑制。此外，PRV 感染还抑制了 H1299 细胞中由亚砷酸钠诱导的 SG 形成，且用另一种 SG 标记蛋白 TIA1 染色也证实了 PRV 感染会阻断亚砷酸钠诱导的 SG 形成。
- PRV 感染促进 G3BP1 核转位：研究人员在 PRV 感染 PK-15 细胞的不同时间点观察 SG 形成动态。从感染后 4 小时起，IE180 蛋白仅在细胞核中表达，且在感染过程中，IE180 与 G3BP1 在细胞核中的共定位越来越强，而未感染细胞中 G3BP1 仅在细胞质中。同时，在 PRV 感染细胞中未检测到 TIA1 标记的 SGs，且 IE180 与 TIA1 存在共定位。在 HSV-1 感染的 Vero E6 细胞中，也发现其即刻早期蛋白 ICP0 和 ICP4 与 G3BP1 在细胞核中共定位，表明 G3BP1 的核定位可能是 α 疱疹病毒感染细胞中的保守现象。
- PRV IE180 蛋白阻断 SG 形成：研究人员转染 PK-15 细胞，分别表达 PRV 的 IE180 或早期病毒蛋白 US1，然后用 poly (I:C) 或亚砷酸钠处理。共聚焦显微镜观察和统计分析显示，IE180 的表达显著抑制了 poly (I:C) 或亚砷酸钠诱导的 SG 形成，说明 IE180 蛋白能有效阻断 SG 形成。
- PRV IE180 与 G3BP1/2 在细胞核中共定位并相互作用：过表达的 IE180-myc 与 G3BP1 在细胞核中共定位，提示二者可能相互作用。免疫共沉淀（co-IP）实验证实了 PRV IE180 与内源性 G3BP1 在感染的 PK-15 细胞中存在相互作用。同时，免疫荧光实验表明，GFP-G3BP1 和 GFP-G3BP2 在 PRV 感染的 PK-15 细胞中均定位于细胞核，并与 IE180 蛋白共定位，co-IP 实验也证实了 IE180 与 GFP-G3BP1、GFP-G3BP2 均有相互作用。
进一步构建 G3BP1 和 IE180 的截短体进行 co-IP 实验，发现 G3BP1 的核转运因子 2 样（NTF2L）结构域和 RNA 结合（RBD，包括 RRM 和 RGG）结构域与 IE180 相互作用，而 IE180 的 ICP4-LP-N 结构域是其与 G3BP1 相互作用所必需的。免疫荧光数据也显示，缺失 ICP4-LP-N 结构域的 IE180 截短体（IE180-C）与 G3BP1 不存在共定位。5. IE180 劫持 G3BP 入核影响 SG 形成：G3BPs 通常存在于细胞质中诱导 SG 形成。研究人员预测 IE180 的核定位序列（NLS），并构建了缺失该序列的 IE180 表达质粒（IE180-ΔNLS-Myc）。转染实验表明，缺失 NLS 改变了 IE180 的亚细胞定位，但不影响其与 G3BP1 的相互作用。与转染 IE180-WT-Myc 的细胞相比，转染 IE180-ΔNLS-Myc 的细胞中，由 poly (I:C) 或亚砷酸钠诱导的 SG 形成显著增加，但仍低于表达 US1-Myc 的细胞，说明 IE180-ΔNLS-Myc 抑制 SG 形成的能力弱于 IE180-WT-Myc。同时，IE180-WT 和 IE180-ΔNLS 均能抑制 poly (I:C) 诱导的 eIF2α 磷酸化水平升高，这可能是 IE180-ΔNLS-Myc 仍具有一定抑制 SG 形成能力的原因。6. PRV 感染和 IE180 表达抑制 eIF2α 非依赖的 SG 形成：poly (I:C) 和亚砷酸钠通过 eIF2α 磷酸化诱导 SG 形成，而 PRV 感染会抑制 poly (I:C) 诱导的 eIF2α 磷酸化水平升高。为探究 PRV 或 IE180 对 eIF2α 非依赖的 SG 形成的影响，研究人员使用 Rocaglamide（RocA），它能通过靶向 eIF4E 复合物以 eIF2α 非依赖的方式诱导 SG 形成。实验结果显示，PRV 感染抑制了 RocA 诱导的 SG 形成，IE180-WT-Myc 转染也能抑制 RocA 诱导的 SG 形成，但 IE180-ΔNLS-Myc 转染则无此效果，表明 PRV 感染和 IE180 表达可通过不涉及 eIF2α 的途径抑制 SG 形成，且缺失预测的 NLS 会使 IE180 失去这种能力。7. G3BP 和 SG 形成损害 PRV 在宿主细胞中的复制：研究人员利用 H1299 G3BP 敲除（H1299 G3BP1?/?）细胞系研究 G3BP 在 PRV 感染中的作用。结果发现，PRV 感染的 H1299 G3BP1?/?细胞中，病毒 gB 蛋白表达水平和病毒滴度均显著高于野生型（WT）细胞。在 H1299 G3BP1?/?细胞中过表达 G3BP1 或 G3BP2，会显著抑制病毒蛋白表达水平和病毒滴度，且共转染 GFP-G3BP1/2 的抗病毒效果更明显。
此外，用 poly (I:C) 和 RocA 诱导 H1299 细胞形成 SGs 后再感染 PRV，发现 PRV-IE180 和 PRV-gB 蛋白水平下降，表明 SG 形成足以抑制 PRV 感染和复制。
讨论
PRV 给全球养猪业带来巨大经济损失，近年来其潜在的人感染病例也引起了公共卫生领域的关注。本研究证实不同 PRV 毒株可抑制 SG 形成，发现 IE180 蛋白是抑制 SG 形成的关键因素，并揭示了其通过与 G3BP 蛋白相互作用并将其劫持入核来阻断 SG 形成的新机制，为理解 PRV 逃避宿主细胞固有抗病毒防御机制提供了新视角。
SGs 在真核细胞抗病毒反应中起关键作用，其形成途径多样。虽然此前有研究表明 PRV 感染抑制 eIF2α 依赖的 SG 形成，但参与抑制的病毒蛋白一直未被报道。本研究发现不同 PRV 毒株在感染早期抑制 SG 形成，且 IE180 蛋白表达足以抑制 SG 形成。
G3BP1 是 SG 形成中蛋白质 - RNA 相互作用网络的核心节点，G3BP2 与 G3BP1 同源，在 SG 组装中也很关键。通常 G3BP 蛋白在细胞质中诱导 SG 组装，但在 PRV 感染时，它们会出现在细胞核中。本研究提出 G3BP1 核转位不利于 SG 形成的假设，并通过实验结果得到支持。同时，研究还发现 IE180 与 G3BP 蛋白相互作用导致其核转位，这是一种全新的干扰 SG 形成的机制。
由于缺失 IE180 基因会使 PRV 无法复制，研究人员构建了缺失 NLS 的 IE180 突变体。虽然突变后 IE180 不能完全定位于细胞质，但部分细胞质定位的 IE180 抑制 SG 形成的能力下降，支持了 IE180 抑制 SG 形成至少部分是由于其将 G3BP 蛋白保留在细胞核中的假设。
此外，研究还发现 HSV-1 的即刻早期蛋白与 G3BP 蛋白在细胞核中共定位，表明这种现象可能在 α 疱疹病毒中保守。在 PRV 感染后期，G3BP1、TIA1 和 IE180 会定位于与病毒 DNA 复制区对应的亚核区域，其功能和生物学意义有待进一步研究。
G3BP1 和 G3BP2 结构相似，本研究确定了 G3BP 的 NTF2L 和 RRM/RGG 结构域在与 IE180 相互作用中起重要作用。同时，研究表明 PRV IE180 可能通过多种方式抑制 SG 形成，除了抑制 eIF2α 磷酸化，其与 G3BP1 的相互作用也可能阻止 G3BP1 诱导 SG 形成。
材料和方法
- 细胞和病毒：实验使用了 PK-15、Vero-E6、HEK293 T 等多种细胞系，以及 PRV-EGFP、PRV-WT、BarthaK61 等病毒株。H1299 WT 和 H1299 G3BP1?/?细胞系由他人馈赠，PRV-EGFP 病毒也由他人提供。
- 细胞培养、药物处理和病毒感染：细胞在添加了 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素 - 链霉素溶液（PS）的杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）中培养。用亚砷酸钠、poly (I:C)、RocA 等处理细胞诱导 SG 形成，病毒感染时先在无血清 DMEM 中感染 1 小时，再换用含 1% FBS 和 1% PS 的 DMEM 维持培养。
- 质粒构建和转染：将 G3BP1/2 及其突变体、IE180 及其突变体等基因克隆到相应质粒中，使用 Lipofectamine 3000 或 Hieff Trans PEI 转染试剂进行转染。
- 组织培养半数感染剂量（TCID50）测定：通过将感染细胞的上清液进行梯度稀释，接种到 PK15 细胞中，观察 EGFP 表达来确定病毒滴度。
- 间接免疫荧光测定：细胞经处理后，依次进行固定、通透、封闭、孵育一抗和二抗、染色等步骤，最后用荧光显微镜或共聚焦显微镜观察。
- 蛋白质免疫印迹分析（Western blot 分析）：细胞裂解后，离心取上清，测定蛋白浓度，进行 SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜后依次进行封闭、孵育一抗和二抗，最后用化学发光成像系统检测信号。
- 免疫共沉淀（co-IP）实验：转染或感染细胞后，裂解细胞，将上清与抗体孵育，再与磁珠结合，洗涤后洗脱共沉淀复合物。
- 流式细胞术分析：转染质粒 24 小时后，收集细胞，洗涤后用流式细胞仪检测 GFP 荧光强度。
致谢
研究感谢提供病毒和细胞系的研究人员，本研究得到了多项国家和省级科研项目的资助，多位研究人员在研究设计、实验操作、数据分析和论文撰写等方面做出了贡献。
