深度突变扫描揭示基孔肯雅病毒 E3/E2 蛋白奥秘，助力疫苗与疗法新突破

基孔肯雅病毒（CHIKV）严重威胁公共健康，抗体在抵御感染中至关重要。本文构建 CHIKV E3/E2 糖蛋白复合体（p62）的深度突变扫描病毒文库，能识别抗病毒抗体关键功能位点，为理解抗体反应、开发疫苗和疗法提供关键工具。

　　

引言

基孔肯雅病毒（Chikungunya virus，CHIKV）是一种由蚊子传播的甲病毒，会引发严重的急性和慢性关节疼痛与炎症，甚至可能致命。已有研究表明，抗 CHIKV 抗体（Abs）在控制 CHIKV 感染中发挥着重要作用，人体研究显示，CHIKV 特异性 IgG 或 IgG 中和抗体（nAbs）的早期出现可预防慢性 CHIKV 疾病的进展。然而，保护性抗体的表位特异性的重要性，以及免疫反应的偏差如何影响症状的缓解或慢性疾病的发展，仍有待深入了解。

CHIKV 是一种包膜、正链 RNA 病毒，其基因组约 12kb，编码两个开放阅读框（ORFs）。第一个 ORF 编码非结构（ns）多蛋白，经加工后产生四个非结构蛋白（nsP1 - 4），负责介导 RNA 合成。第二个 ORF 编码病毒结构蛋白，包括衣壳蛋白、p62、6K/TF 和 E1。E1 和 p62 在内质网中共翻译并糖基化，在分泌途径中，p62 被弗林蛋白酶切割成成熟的 E2 和 E3 糖蛋白。对于某些甲病毒，包括 CHIKV，E3 可与成熟的 E2 - E1 异二聚体结合。E2 和 E1 异二聚体在病毒粒子表面形成 80 个三聚体刺突，E2 蛋白由三个结构域（A、B 和 C）组成，E1 是一种 II 类融合蛋白，有三个结构域（I、II 和 III），E2 和 E1 是中和抗体的主要靶标。

本研究通过深度突变扫描（DMS）技术对 CHIKV 的 p62 进行研究，以高通量的方式同时测试数千个 p62 突变体在不同选择压力下的表现。DMS 技术已被应用于多种病毒的研究，具有多种应用，包括评估治疗性单克隆抗体（mAbs）及其表位、为病毒进化模型提供信息等。由于 CHIKV 的 p62（E2/E3）参与细胞的进入和释放过程，研究人员构建了全长 CHIKV 质粒系统，以探究某些突变对病毒适应性的影响。

研究人员评估了 CHIKV - p62 - DMS 文库的多样性，推断了 CHIKV p62 的突变耐受性。利用两种特征明确的 CHIKV 单克隆抗体（CHK - 152 和 CHK - 265）验证文库识别中和抗体重要功能位点的能力，还测试了文库对未明确定位靶点的单克隆抗体（CHK - 11）中和活性相关位点的定位能力。

结果

1. CHIKV - p62 - DMS 病毒文库的特征：高多样性和功能变体选择中和 CHIKV 的抗体主要靶向 E2 和 E1 表面糖蛋白，但 E3 在中和抗体反应中的作用尚不清楚。研究人员对 p62 胞外域进行深度突变扫描，以识别 E3/E2 中影响抗体介导的 CHIKV 感染抑制作用的突变。

CHIKV - p62 - DMS 病毒文库是在 pCHIKV - CMV - mKate 质粒的基础上构建的。将质粒文库（mutDNA）转染到 HEK293 细胞中，在转染后 48 小时收集含有病毒的培养上清液，得到第一个病毒文库（mutVirus.p1）。为了筛选出功能变体，用 mutVirus.p1 以 0.01 FFU / 细胞的感染复数（MOI）接种 Vero 细胞，在感染后 48 小时收集含有病毒的培养上清液，得到 mutVirus.p2。选择 Vero 细胞是因为其常用于单克隆抗体表位作图研究和中和试验，便于与先前研究进行比较。

研究人员对 40 个细菌菌落的质粒 DNA 进行 Sanger 测序以评估诱变效率。结果显示，40 个克隆中有 4 个（10%）因连接反应失败或污染而被排除，其余 36 个克隆中，非同义突变和同义突变的平均数量分别为 2.2 和 0.08。由于 4 个克隆（11%）存在终止密码子，被排除在分析之外，使得每个功能克隆的非同义突变平均数量降至 2.0。非同义突变在采样序列中分布相对均匀。

通过对 mutVirus.p1、mutVirus.p2 以及 mutDNA 和野生型（WT）质粒的 RNA 进行深度测序，评估文库序列多样性。结果显示，mutDNA、mutVirus.p1 和 mutVirus.p2 文库中每个位置检测到的平均氨基酸数量（“ndet”）分别为 15.9、14.2 和 8.9，而 wtDNA 样本每个位置平均检测到 2.6 个氨基酸。对于 mutVirus.p2，计算其标准 DMS 指标 —— 每个位置的有效氨基酸数量（“neff”），平均值为 9.0。这些结果表明，该文库实现了高度诱变，并且在传代后进行了功能选择。2. E2 B 结构域的多样性增加为了更直观地展示深度测序数据中氨基酸的存在或缺失情况，研究人员开发了新的指标 “ndet”，并使用软件包 megaLogo 进行可视化。通过对 mutVirus.p2 的过滤数据集进行处理并绘制 logoplot 图，同时生成相应的热图，以展示 E3 的突变耐受性。

logoplot 图和结构热图显示，在某些位点（如野生型半胱氨酸残基）和构象相关区域（如 E2 B 结构域的三聚体核心和中心脊），突变耐受性有限；而在 E3（如 13 - 25 位）以及 E2 A 和 B 结构域的部分区域，突变耐受性较高，表现为更多的氨基酸堆积和更红的热图颜色。通过对每个结构域的 “ndet” 分布进行绘图，发现 E2 B 结构域中具有较高检测氨基酸数量的位点比其他 E2 结构域更多，表明 B 结构域具有更大的可塑性。3. 绘制 CHIKV 中和抗体的逃逸图谱，识别新的逃逸位点为了验证 CHIKV - p62 - DMS 文库病毒用于识别病毒逃逸中和抗体机制的有效性，研究人员使用两种特征明确的抗 CHIKV 单克隆抗体 CHK - 152、CHK - 265 以及未定位的抗 CHIKV 单克隆抗体 CHK - 11 进行逃逸突变体选择试验。

将每种单克隆抗体与野生型病毒（wtVirus）或 mutVirus.p2 在 37°C 预孵育 1 小时，使用 2×EC₉₇的单克隆抗体与病毒混合液接种 Vero 细胞，在感染后 24 小时对产生的病毒进行测序，以分析差异选择。结果显示，所有单克隆抗体在 p62 上都有适度的阳性位点逃逸分数，并且在多个位点发现了具有高差异选择分数（>10 log₂）的个体突变体。

研究人员进一步验证结果，评估已知的 CHK - 152 和 CHK - 265 接触位点或关键残基中阳性逃逸位点的识别情况。结果显示，CHK - 152 先前发表的 9 个位点中有 9 个（100%）至少有一个逃逸突变体，CHK - 265 的 59 个位点中有 54 个（92%）有逃逸突变体，与先前研究结果一致。

为了确定该文库能否识别新的关键位点，研究人员选择了一组不在已知残基范围内的突变体进行中和逃逸测试。选择标准包括位于含有已知接触位点的结构域中的新位点或无已知接触位点的结构域中的位点、在至少两种单克隆抗体中作为顶级逃逸突变体得分、不是先前确定的逃逸或接触位点、最好是表面暴露的位点。最终选择的突变体包括 E3 D40C、E3 Q49P、E2 P75K、E2 E79D（A 结构域）、E2 T179M、E2 N219P（B 结构域）、E2 L241M（Arch 2）等。

对这些突变体进行中和能力评估，结果显示，大多数突变体对每种单克隆抗体仅表现出适度的逃逸，EC₅₀有 2 - 4 倍的变化。但 E2 L241M 对 CHK - 11 在测试稀释度下无法计算 EC₅₀，E2 N219P 突变则使病毒对 CHK - 265 和 CHK - 11 的中和活性丧失，无法计算 EC₅₀，而对 CHK - 152 仅表现出适度的 2 倍逃逸。4. CHK - 11 与 CHK - 265 靶向重叠表位并具有广泛中和活性由于 CHK - 11 和 CHK - 265 的逃逸谱相似，研究人员通过竞争酶联免疫吸附试验（ELISA）评估它们是否靶向重叠表位。结果显示，CHK - 265 对 CHK - 11 与病毒结合的阻断程度与自身竞争对照相似，表明两者存在显著的表位重叠或空间位阻；而 CHK - 152 对 CHK - 11 结合的抑制作用较弱，表明其表位重叠或空间位阻有限。

先前研究表明 CHK - 265 是一种对致关节炎甲病毒具有广泛中和活性的单克隆抗体，研究人员通过比较 CHK - 11 和 CHK - 152 对另外三种致关节炎甲病毒（o’nyong’nyong 病毒（ONNV）、马亚罗病毒（MAYV）和罗斯河病毒（RRV））的中和活性，探究 CHK - 11 是否也具有广泛中和活性。结果显示，CHK - 11 能中和 CHIKV 和 MAYV，对 ONNV 和 RRV 的中和作用较弱；CHK - 152 能中和 CHIKV 和 ONNV，对 RRV 和 MAYV 的感染性降低作用较小。

最后，通过对 CHK - 11 和 CHK - 265 共享的逃逸突变体的差异选择分数进行相关性分析，发现两者具有很强的相关性（R² = 0.704，P < 0.0001），而 CHK - 11 与 CHK - 152、CHK - 265 与 CHK - 152 的相关性较弱，表明 CHK - 11 和 CHK - 265 可能比它们与 CHK - 152 相比，共享更多的接触位点或构象依赖性。

讨论

明确如何调节免疫系统以更好地预防未来 CHIKV 疫情至关重要。本研究构建、表征并功能验证了 CHIKV p62 DMS 病毒文库，该文库能够鉴定抗病毒抗体的关键功能位点。

研究发现，CHIKV p62 胞外域的不同区域表现出不同的突变耐受性，E2 B 结构域能够耐受更多氨基酸替换的位点比例较高，这可能与其广泛的蛋白质相互作用有关，包括与细胞受体和抗体的结合，这种可塑性使其能够在体外快速适应限制性细胞类型。相反，E2 A 结构域的部分表面暴露区域和三聚体 “核心” 对氨基酸替换的耐受性较低，这些区域可能是治疗或疫苗免疫原的潜在靶点。此外，E3 糖蛋白的功能尚未完全阐明，本研究的突变耐受性数据有助于确定 E3 的更多功能以及关键结构域和残基。

本研究对先前描述的 DMS 突变耐受性指标 “neff” 进行了改进，提出了 “ndet” 指标。通过比较发现，“ndet” 和 “neff” 的结果相似，但 “ndet” 在处理低初始读数位置时更具优势，能够避免高估突变耐受性值。

研究验证了文库识别已知单克隆抗体功能位点的能力，不仅确认了先前发表的关键位点，还发现了新的逃逸突变体，如 E2 N219P，进一步证明了更全面的 DMS 功能位点映射试验的实用性。

对于未定位的单克隆抗体 CHK - 11，文库也能够识别关键残基。通过一系列实验表明，CHK - 11 与 CHK - 265 具有相似的表位和广泛中和活性，这为进一步研究 CHIKV 抗体反应提供了重要信息。

然而，本研究也存在局限性。在引入突变的方法中，每个克隆可能会获得多个突变，且诱变区域长度超过大多数短读长测序平台的标准读长，可能导致观察到的表型受到读框外突变的干扰。尽管通过单独引入代表性逃逸突变并测试中和逃逸来验证测序结果，但部分突变的逃逸程度比测序预测的更为温和，这可能与所测试的广泛中和抗体的特性或甲病毒的特定因素有关。未来研究可以纳入更多的抗体和逃逸突变体，以确定本研究结果是否适用于其他抗 CHIKV 单克隆抗体，以及更窄谱的抗体是否会在连续的残基区域内表现出更大的位点差异选择分数。

总体而言，本研究展示了一种表征甲病毒突变耐受性的方法，并可用于在高通量系统中绘制中和抗体的关键位点，为理解适应性免疫反应如何调节以更好地预防 CHIKV 和其他新兴甲病毒的感染和疾病提供了重要见解。

材料和方法

1. 质粒设计：将 CHIKV AF15561 序列克隆到人类 CMV 启动子下游，在 CHIKV 3′ - UTR 下游插入 SV40 poly A 序列，在病毒基因组的 poly A 尾附近插入丁型肝炎病毒核酶。为了便于识别感染细胞和作为生物安全特征，对病毒基因组进行工程改造，使其在病毒结构多蛋白中编码荧光蛋白 mKate。在 p62 胞外域两侧引入 ApaI 和 XhoI 位点，便于将诱变的 p62 片段克隆到 pCHIKV - CMV - mKate 骨架中。构建了两种质粒变体，一种去除 CHIKV 非结构蛋白以减少文库诱变时的模板携带背景，另一种在诱变的 p62 区域的 E3 部分引入两个终止密码子，以减少野生型病毒的下游过表达。
2. 诱变和克隆：对 pCHIKV - CMV - mKate 质粒进行 ClaI 酶切和重新连接，分离出含有 p62 的片段，用于扩增 E3/E2 糖蛋白区域进行诱变。采用 NNK 方法设计诱变引物，使用 Codon Tiling Primers Python 脚本生成引物，优先保证引物的解链温度相等，然后将所有引物等摩尔浓度混合。进行正向和反向诱变 PCR 以及连接反应 PCR，均只进行一轮以降低密码子突变频率。连接反应 PCR 产物经凝胶纯化后，与经 ApaI 和 XhoI 酶切、碱性磷酸酶去磷酸化的 pCHIKV - CMV - mKate 质粒（E2 中含有两个终止密码子突变）进行连接。连接产物电转化到 ElectroMAX DH10B 大肠杆菌细胞中，进行转化、培养和菌落分析。
3. 质粒文库转染和文库病毒感染：将突变病毒文库转染到 HEK293 细胞中，转染前细胞在 150mm 培养皿中培养，转染时使用 Lipofectamine 3000 按照制造商建议进行操作，在转染后 48 小时收集病毒上清液和细胞。将文库病毒以 0.01 FFU / 细胞的 MOI 感染 Vero 细胞，吸附 1 小时后添加 D10 培养基，继续培养 48 小时。
4. 病毒滴度测定试验：采用焦点形成试验（FFA）和噬斑试验测定病毒滴度，FFA 用于大多数病毒，噬斑试验用于 ONNV、MAYV、RRV 和 CHIKV E2 N219P（以及野生型 CHIKV 对照病毒）。数据使用 Microsoft Excel 和 GraphPad Prism v10.1.1 进行分析。
5. 单克隆抗体制备：由 Michael Diamond 提供 CHK - 11、CHK - 152 和 CHK - 265 的杂交瘤。杂交瘤在完全 IMDM 培养基中扩增，转移到 2L 滚瓶中培养，7 天后补充无血清培养基，待大多数细胞死亡后收集上清液，经过滤灭菌、浓缩和纯化后，通过基于病毒粒子的 ELISA 进行定量。
6. 噬斑和焦点减少中和试验：焦点减少中和试验（FRNTs）和噬斑减少中和试验（PRNT）按照先前描述的方法进行。在病毒感染 Vero 细胞前，将病毒与一系列稀释的单克隆抗体在 37°C 预孵育 1 小时，感染后进行相应处理和数据分析。
7. 单克隆抗体挑战试验：将单克隆抗体与病毒在 37°C 孵育 1 小时，然后将病毒 - 单克隆抗体混合物添加到 Vero 细胞中，孵育、洗涤并添加新鲜培养基，在感染后 16 - 18 小时收集上清液，测定病毒滴度和进行病毒 RNA 测序。
8. 突变病毒制备：使用 QuikChange II XL 定点诱变试剂盒对质粒 DNA 进行定点诱变，转化到 XL - 10 Gold 细胞中，进行小量制备和测序验证。选择克隆进行中量制备，然后进行体外转录。体外转录后，将转录产物电穿孔到 BHK - 21 细胞中，24 小时后收获细胞，通过 FFA 测定病毒滴度。
9. 验证 CHK - 152 和 CHK - 265 的关键位点：对先前确定的 CHK - 152 中和