揭秘微藻硅积累奥秘：从海洋到淡水，探寻生物硅循环新机制

《Applied and Environmental Microbiology》：The evaluation of biogenic silica in brackish and freshwater strains reveals links between phylogeny and silica accumulation in picocyanobacteria

本文聚焦于浮游蓝细菌生物硅（bSi）积累研究。通过对海洋、咸淡水蓝细菌菌株的研究，发现咸淡水菌株在添加溶解硅（dSi）后硅含量显著上升，且蓝细菌硅积累与系统发育有关，其生长还会引发 pH 相关的硅沉淀，影响硅循环。

　　### 研究背景
硅（Si）在水生系统的生物地球化学循环中起着关键作用。在生物矿化过程中，生物体吸收溶解硅（dSi，以正硅酸形式存在）并将其沉积为生物硅（bSi）。长期以来，硅藻被认为是海洋生态系统中最重要的生物硅化者，它们通过吸收 dSi 构建细胞壁，在碳、硅等元素的循环中发挥着核心作用，是连接硅、碳等生物地球化学循环的重要桥梁，对海洋碳和生物硅向深海的输出贡献巨大。

然而，近年来的研究表明，海洋硅循环比之前认知的更为复杂。海洋微微型浮游植物（直径小于 2μm 的原核和真核光合细胞）尽管对硅没有绝对需求，但却能积累大量硅，在硅循环中扮演着重要角色。在寡营养的东印度洋、西太平洋以及马尾藻海、热带南太平洋等海域，微微型浮游植物对生物硅存量的贡献相当显著。

在蓝细菌中，已有研究发现海洋聚球藻（Synechococcus）能够积累硅，其硅磷比可与硅藻相媲美。实验室研究也证实，部分海洋聚球藻菌株在 dSi 浓度增加时会积累硅，但不同菌株间硅积累差异显著，且这种差异与菌株的生态生理学或系统发育之间的关系尚未明确。

在真核生物中，生物硅化机制已得到较为深入的研究，涉及酸性硅沉积囊泡中的 dSi 吸收以及可控的无定形 bSi 沉淀过程，并且分子比较研究推测生物硅化在多个真核生物谱系中独立起源。在硅藻中，生物硅化的多个过程受到 dSi 可用性的转录调控，dSi 的吸收由高亲和力的 dSi 转运蛋白（SITs）介导。相比之下，细菌和古菌中的生物硅化研究相对较少，虽然已报道在一些异养和光合细菌中存在生物硅化现象，并且在少数异养细菌和聚球藻菌株中发现了 SIT 相关转运蛋白（SIT-Ls），但 SIT-Ls 在聚球藻中的功能尚未得到实验验证，且聚球藻积累的并非传统意义上的 bSi，而是一种含有镁和 / 或钙离子的水合硅质网络。此外，常用的细胞 bSi 分析方法（如碱性消化法）存在局限性，只能间接测量 bSi，而且硅积累容易受到培养基 pH 条件的影响，在 pH 高于 8.5 时会发生无机硅沉淀，这使得准确评估蓝细菌中的生物硅化过程变得困难，因此需要更完善的方法来研究这一现象。

同时，以往关于蓝细菌 bSi 积累的研究大多集中在海洋环境，而蓝细菌在咸淡水和淡水系统的初级生产中同样意义重大。在这些水域中，蓝细菌种群多样且数量丰富，dSi 浓度适宜，具备生物硅生产的良好条件。有研究发现淡水浮游植物中的微囊藻（Microcystis aeruginosa）和水华束丝藻（Dolichospermum flosaquae）含有大量 bSi，这表明淡水蓝细菌也可能具有硅积累能力。但目前尚不清楚蓝细菌的生物硅化现象是仅存在于海洋环境，还是在不同盐度梯度的水域中都有分布。因此，深入了解蓝细菌在不同水生栖息地的 bSi 积累情况，对于评估其在全球硅循环及其他生物地球化学循环中的作用至关重要。

材料与方法

1. 蓝细菌菌株及培养条件：本研究选用了 37 株蓝细菌菌株，涵盖海洋、淡水参考菌株以及新分离的咸淡水菌株，这些菌株在色素组成上具有多样性。实验中，海洋和咸淡水菌株分别在添加人工海盐的 L1 培养基（咸淡水菌株盐度为 7 PSU，海洋菌株为 35 PSU）中培养，淡水菌株则在 BG11 培养基中培养。所有菌株均在无 dSi 添加的培养基中培养，培养温度为 18°C，光照强度为 100 μmol 光子 m^?2 s^?1，光暗周期为 12 小时光照∶12 小时黑暗。实验所用培养基和储备液均存储在聚碳酸酯瓶中，以减少 dSi 的额外来源，但由于培养基成分和自来水中存在痕量 dSi，实验中对照组的 dSi 浓度在接种前处于较低的微摩尔范围（L1 7 PSU 培养基中约为 1.4 μM，L1 35 PSU 培养基中约为 2.2 μM，BG11 培养基中约为 4.4 μM）。
2. 细胞 bSi 积累实验：选取 11 株蓝细菌菌株进行硅积累测试，其中海洋菌株Synechococcus sp. WH 5701 作为阳性对照，因为此前已有该菌株积累硅的报道。另外，从波罗的海选取了 8 株近期完成生理特征鉴定的咸淡水菌株，以及淡水代表菌株Synechococcus elongatus PCC 7942 和Synechocystis sp. PCC 6803。

考虑到在批次培养中，pH 高于 8.5 时会诱导无机硅以海泡石（Mg₂Si₃O₈）的形式沉淀，干扰细胞硅含量的测量，研究人员对两种调节 pH 的处理方法进行了测试，并评估其对两株咸淡水菌株（BA 120 和 BA 124）和一株海洋菌株（WH5701）硅积累的影响。这两种处理方法分别是：向培养物中通入预先灭菌的环境空气（空气经 0.2-μm 过滤器过滤后进入培养瓶）；在培养物中加入搅拌（100 rpm 的轨道振荡），并使用 4-(2 - 羟乙基) 哌嗪 - 1 - 乙磺酸（HEPES）在两种浓度（5 mM 和 10 mM）下将 pH 缓冲至 7.5。实验前将培养基 pH 调至 7.5，实验过程中每天密切监测 pH。最终，研究人员选择通气培养的方式进行后续实验。

为评估 bSi 积累，实验选用处于指数生长早期的细胞接种到添加 100 μM dSi 的培养基中。该 dSi 浓度既不会影响无硅需求的真核和原核微微型浮游植物的生长，又处于 dSi 可通过转运蛋白介导吸收的浓度范围。实验以不添加 dSi 的 L1 和 BG11 培养基作为对照。在实验前，将细胞系在实验条件下驯化 15 - 18 天，以维持其生理稳定性，并且在实验前将处于指数生长期的细胞系至少传代三次。

实验过程中，每天通过光密度（OD 750_nm）监测细胞生长情况，因为该参数与通过流式细胞术和细胞计数确定的细胞浓度呈强正相关。当培养物达到指数生长中期时，取样测定 dSi、bSi 含量以及进行细胞计数。对于海洋菌株 WH 5701 和咸淡水菌株 KAC 102，还额外取样进行全转录组分析，以评估添加 dSi 的影响。此外，通过在荧光显微镜下（1000 倍放大）测量 30 个细胞的直径来估计细胞大小，并利用几何形状（球体和椭球体）估算平均生物体积（μm³）。研究人员还研究了在未调节 pH 的情况下，蓝细菌批次培养中无机硅沉淀的程度，实验方法与上述硅积累实验类似，但培养物在轨道振荡器（100 rpm）中培养，每天取样监测生长（通过光密度 OD 750_nm）、pH 变化和 dSi 含量，在指数生长中期取样测定细胞 bSi 含量和细胞计数。
3. dSi、bSi 和干重测定：测定 dSi 时，取 5 mL 细胞悬浮液通过 33-mm 直径、0.22 μm 孔径的 Millex-GP 过滤器（Millipore，爱尔兰）过滤，然后将滤液储存于 - 20°C，采用硅钼酸抗坏血酸法测定 dSi 浓度。测定 bSi 含量时，取 20 - 30 mL 细胞悬浮液过滤到 47-mm 直径、0.2 μm 孔径的 Nuclepore Track-Etch 过滤器（Whatman，英国）上，将过滤器置于特氟龙管中于 - 20°C 保存，随后在 0.2 M NaOH 中 95°C 消化 1 小时，使硅转化为 dSi，再使用 UV-1600PC 分光光度计（岛津，日本）在 810 nm 波长下、50-mm 比色皿中进行测量。取 1 mL 培养物用鲁哥氏溶液固定，通过显微镜下的 Neubauer 计数板进行细胞计数，并结合流式细胞术以避免因部分菌株形成细胞聚集体而导致的计数误差。细胞硅含量通过总 bSi 除以细胞数量计算得出，需要注意的是，该方法测定的 bSi 包含来自活细胞和碎屑物质的硅。

测定干重时，在指数生长中期（OD_{750 nm}≈ 0.3）收集约 500 mL 细胞悬浮液，在 4°C、6,000 × g的条件下离心 20 分钟，然后在 0.13 毫巴的压力下冷冻干燥（VirTis BenchTop Pro）至完全干燥。
4. DNA 提取：取 10 mL 培养物，在 8,000 x g的条件下离心 8 分钟，收集细胞用于总基因组 DNA 的提取。采用 FastDNA SPIN Kit for soil（MP Biomedicals）试剂盒和 Lysing Matrix E 管（MP Biomedicals）进行 DNA 提取，具体操作按照试剂盒说明书进行，并在使用 FastPrep-24 5G 珠磨研磨和裂解系统匀浆后，加入蛋白酶 K（终浓度 1%）于 55°C 孵育 1 小时。使用 Invitrogen Qubit 2.0 荧光计（赛默飞世尔科技公司）测量 DNA 浓度，使用 Thermo Scientific NanoDrop 2000 分光光度计（赛默飞世尔科技公司）评估 DNA 纯度。用于全基因组测序的 DNA 提取采用相同步骤，只是在加入蛋白酶 K 孵育前使用涡旋混合器进行匀浆。提取的 DNA 样本储存于 - 20°C，待送至瑞典国家基因组基础设施 SciLifeLab（位于斯德哥尔摩）进行测序。
5. RNA 提取和测序：通过全转录组分析评估两株蓝细菌菌株（海洋菌株 WH 5701 和咸淡水菌株 KAC 102）对 dSi 添加的响应。在指数生长期，分别收集在无 dSi 添加（对照）和 dSi 富集（+100 μM）培养基中培养的 30 mL 培养物，在 8,000 x g 的条件下离心 12 分钟，将细胞沉淀迅速用液氮冷冻并储存于 - 80°C。使用 RNeasy Mini Kit（Qiagen）试剂盒按照改编自相关文献的方案提取总 RNA。具体操作如下：将细胞沉淀重悬于裂解混合液（1 mL buffer RLT 加 10 μL β- 巯基乙醇）中，加入 Lysing Matrix E 管（MP Biomedical），使用 FastPrep-24 5G 珠磨研磨和裂解系统在 6.0 m s^?1的速度下匀浆 3 次，每次 30 秒，然后在 4°C、5,000 x g的条件下离心 5 分钟。将上清液转移至含有等体积 70% 乙醇的管中，多次吹打混匀，用预热至 50°C 的无 RNase 水两次洗脱总 RNA，每次 30 μL。使用 TURBO DNA-free Kit（赛默飞世尔科技公司）去除 DNA，使用 RiboMinus Transcriptome Isolation Kit 和 RiboMinus Concentration Module（赛默飞世尔科技公司）去除核糖体 RNA。使用 TapeStation（安捷伦）评估 RNA 完整性，使用 NanoDrop 2000 分光光度计（赛默飞世尔科技公司）测量 RNA 质量，使用 Qubit 2.0 荧光计（赛默飞世尔科技公司）定量 RNA 浓度。RNA 样本储存于 - 80°C，待送至 Eurofins Genomics 公司在 Illumina NovaSeq 6000 S4 平台上进行测序，测序模式为 PE 2 × 150 bp。转录序列可在欧洲核苷酸档案库（ENA）中获取，登录号为 PRJEB76927。

测序得到的 reads 使用 nf-core/magmap 预发布版本（修订版 6518a0dc1b）映射到参考基因组。该流程使用 Trimgalore（v. 0.6.7）和 Cutadapt 软件对序列进行接头修剪和质量过滤，修剪后的高质量 reads 使用 BBMap（v. 38.92）映射到相应的参考基因组（菌株 WH5701 和 KAC 102），并使用 Subread 包 v. 2.0.1 中的 featureCounts 对特征进行定量。感兴趣基因的表达水平以每百万转录本数（TPM）表示，即目标转录本在总测序转录本中的基因长度校正相对丰度。使用 Vegan v. 2.6.4 和 Tidyverse v. 2.0.0 软件包在 R v. 4.2.1 环境中进行非度量多维缩放（NMDS）和 Hellinger 主成分分析（PCA），以评估添加 dSi 处理的样本（添加 100 μM dSi 的培养基培养）与对照样本（未添加 dSi）之间的差异。使用 ALDEx2 v. 1.30.0 软件进行差异表达基因的检验。
6. 基因组测序和注释：取 1 μg 菌株 KAC 102 的基因组 DNA，按照制造商的说明（Pacific Biosciences，美国加利福尼亚州门洛帕克）构建 SMRTbell 测序文库，并在 PacBio Sequel II 仪器上进行测序，测序时间为 30 小时，获得约 320 Mb 的序列数据。使用 Flye v2.8.3、hifiasm-meta 和 hifiasm（v. 0.16.1）软件，采用默认参数对基因组进行组装，并使用 pbmm2 进行映射和选择最佳重叠群，得到最终组装结果。使用 checkM（v.1.1.3）评估组装基因组的完整性，使用 Prokka（v.1.14.6）进行功能注释。使用 GTDB-Tk（v. 2.1.0）和 GTDB 版本 R07RS207 确定菌株的分类地位（属于 Cyanobiaceae 科的 GTDB 物种 “CBW1002 sp015840915”）。从 NCBI 下载Synechococcus sp. WH5701 的基因组组装文件（登录号 GCF_000153045.1），并按照 KAC 102 的注释方法进行注释。KAC 102 的基因组可在欧洲核苷酸档案库中获取，登录号为 GCA_963920495。
7. 系统发育分析：对本研究中使用的 37 株咸淡水和淡水蓝细菌菌株，以及先前报道的积累硅的Synechococcus菌株和含有 SIT-Ls 的菌株进行系统发育分析。使用通用引物 27F 和 1492R 扩增 16S rRNA 基因片段（约 1,400 pb），扩增反应条件为：98°C 初始变性 5 分钟，然后进行 30 个循环，每个循环包括 98°C 变性 40 秒、55°C 退火 40 秒、72°C 延伸 1 分钟，最后 72°C 延伸 10 分钟。PCR 产物送 Macrogen Europe 公司（荷兰阿姆斯特丹）进行 Sanger 测序。使用 MAFFT v. 7.5 软件的 G-INS-I 算法（默认参数）对 16S rRNA 基因序列进行比对。采用最大似然法和贝叶斯推断法进行系统发育计算。最大似然系统发育树使用 IQ-TREE v. 1.6.12 软件，基于 ModelFinder 确定的 GTR + F + I + I + R3 模型构建，自展值计算设置为 1,000 次重复。贝叶斯推断系统发育树使用 MrBayes v3.2.7a 软件，在 GTR + I + gamma 模型（lset nst = 6 rates = invgamma）下构建，进行两个运行，每个运行包含八个马尔可夫链，运行 20,000 代，最终平均分裂频率的标准偏差低于 0.01。
8. 数据分析：硅积累实验设置了三到四个生物学重复，结果以平均值（± 标准差，SD）表示，且至少进行了三次独立实验。特定生长速率根据指数生长期的光密度（OD 750_nm），按照公式μ=tf??ti?ln(ODti??ODtf???)?计算，其中tf?和ti?分别代表指数生长期的最终和初始天数。

使用单因素和双因素方差分析分别分析不同处理和不同菌株下细胞 bSi 含量和生长速率的差异。使用 Shapiro-Wilk 检验残差的正态分布，必要时对数据进行平方根转换。当发现显著差异（P<0.05）时，使用 Tukey 事后检验进行组内多重比较。使用 GraphPad Prism Version 9.3.1 for MacOS 软件绘制图表，使用 R 语言中的 car 和 lsmeans 软件包进行统计分析。
9. 蓝细菌中 dSi 转运蛋白和与硅沉积相关蛋白的搜索：首先在公共数据库中搜索 d<