Growth-coupled continuous directed evolution by MutaT7：酶工程的自动化高效新策略

《Applied and Environmental Microbiology》：Growth-coupled continuous directed evolution by MutaT7 enables efficient and automated enzyme engineering

这篇研究开发了一种生长偶联连续定向进化（GCCDE）方法，通过将 MutaT7 系统与细菌生长偶联，实现了酶的自动化高效工程改造。以嗜热酶 CelB 为对象，成功筛选出在低温下活性增强且热稳定性保留的变体，为酶工程提供了新途径。

　　

研究背景

在生命科学领域，定向进化是改造蛋白质和调控元件的有力工具，它模拟自然进化过程，在实验室中通过引入遗传多样性并选择有利表型，快速提升酶等蛋白质的性能，广泛应用于治疗、诊断和代谢工程等多个方面。然而传统的定向进化依赖于体外诱变、转化和选择或筛选的迭代循环，这些过程不仅耗费大量人力和时间，还限制了蛋白质工程的效率和可扩展性。

为突破这些限制，体内定向进化方法应运而生，如噬菌体辅助连续进化（PACE）、正交 DNA 复制（OrthoRep）和 MutaT7 系统等。其中 MutaT7 系统利用由 T7 RNA 聚合酶与胞苷脱氨酶融合而成的超突变嵌合蛋白，在细菌细胞内高效产生突变，能在 T7 启动子下游区域引入 C 到 T 或 G 到 A 的突变，后续改进版本可诱导所有可能的转换突变，相比体外方法，极大加速了蛋白质工程进程。但体内诱变虽然提升了定向进化效率，高通量选择仍是主要瓶颈。生长偶联定向进化策略通过将酶活性与细菌生长在选择性条件下建立联系，解决了这一问题。具有增强活性的酶变体促进细菌更快生长从而富集，功能较弱的变体则在细胞群体竞争中被淘汰，该策略实现了体内酶变体的高通量选择并便于自动化操作 。

本研究将 MutaT7 诱变与连续培养技术相结合，开发了生长偶联连续定向进化（GCCDE）系统，用于高效的酶进化。此系统将自动化诱变、选择和富集整合在连续培养体系中，避免了传统方法中易错 PCR、转化和筛选的迭代循环，减少了时间和人力成本，能快速进化大型变体库，并可精确调整长期的选择压力。研究以嗜热酶 CelB 为对象，旨在增强其在较低温度下的 β - 半乳糖苷酶活性，同时保持热稳定性，以此验证 GCCDE 系统的有效性。

实验设计

在生长偶联体内定向进化中，关键是建立细菌生长与目标酶活性的直接联系。这需要使用缺乏目标酶天然活性的宿主细菌菌株，确保在特定培养基中细菌生长完全依赖于通过质粒导入的酶活性。培养基中含有酶的底物，其被转化为细菌增殖所需的必需营养物质，酶活性越高的变体利用底物越高效，细菌生长越快，随着时间推移优势变体得以富集。

研究选择嗜热的 CelB 蛋白作为目标，以大肠杆菌 Dual7 菌株为宿主进行实验。Dual7 菌株源自 DH10B，其 lacZ 基因发生突变，β - 半乳糖苷酶活性极低，并且该菌株将 MutaT7 蛋白整合到染色体中，可由乳糖或异丙基 β - D - 1 - 硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导表达，同时携带 Δung 突变，能防止诱导突变的修复，提高体内诱变效率。将含有 CelB 质粒文库的 Dual7 菌株在以乳糖为唯一碳源的最小培养基中培养，活性增强的 CelB 变体可更有效地将乳糖转化为葡萄糖和半乳糖，促进细菌更快复制，而活性较低的变体所在细胞生长缓慢，在连续培养系统中逐渐被淘汰，从而实现高活性 CelB 变体的富集。实验通过逐渐将培养温度从 37°C 降低到 27°C 施加选择压力，促使具有更低温度下更高活性的 CelB 变体进化。

研究设计了简单的遗传电路用于灵活的基因调控。使用低拷贝数质粒携带在杂合启动子 P_tetO 控制下的 celB 基因，使 CelB 表达受外部诱导剂无水四环素（aTc）调控。培养基中的乳糖激活 MutaT7 蛋白表达，启动体内诱变。celB 基因下游的 T7 启动子驱动进化朝不同方向进行，确保诱变和 CelB 表达的独立调控，T7 终止子位于杂合启动子 P_tetO 上游，可减少脱靶突变。该系统还存在一个负反馈回路，当 CelB 活性增加，乳糖代谢增多，用于 MutaT7 表达的乳糖减少，突变率自然降低，这一机制在目标蛋白接近最佳功能时有助于稳定系统，虽在当前实验中因培养基乳糖浓度高饱和 LacI 蛋白而未显著发挥作用，但对未来体内定向进化的电路设计具有潜在价值。

为弥补 MutaT7 仅引入转换突变的局限，研究在启动体内诱变前，利用易错 PCR 从 CelB 质粒生成起始文库，引入多样化突变，结合体外和体内诱变可扩大 CelB 的遗传多样性，改善系统进化结果。通过将诱变、选择和富集整合为一个自动化过程，研究实现了 CelB 的高效高通量进化，连续培养系统在进化实验中任何时刻都能支持大量变体库（每个培养物约 1.7×10?个进化细胞）的进化，在极少人工干预下快速优化 CelB。

筛选和表征 CelB 变体

进化实验结束后，使用蓝白斑筛选方法在含有 X - gal 和 aTc 的 LB 琼脂平板上对培养物进行筛选。深蓝色菌落表示 CelB 活性较高，挑选这些菌落并在含有 aTc 的 LB 培养基中培养诱导 CelB 表达。诱导孵育后，将细胞在 75°C 加热 15 分钟，获得粗细胞裂解物，随后在 96 孔板中进行氯酚红 -β - D - 半乳糖吡喃糖苷（CPRG）测定，以确认其 β - 半乳糖苷酶活性。加热处理有两个目的，一是筛选热稳定的 CelB 变体，二是破坏细菌细胞膜，使 CPRG 能进入细胞进行酶活性检测 。

在 CPRG 测定中表现出相对高活性的十个变体被挑选出来进一步研究。并非所有蓝白斑筛选出的菌落都比野生型酶活性显著更高，这是因为初步筛选基于粗细胞裂解物，实验存在一定变异性。部分突变体活性与野生型相似，可能是由于 CPRG 测定前 75°C 的热处理破坏了其热稳定性，虽然 CPRG 测定在室温进行，但之前的热处理步骤可能影响了这些变体的稳定性。与野生型 CelB 相比，AA10、T1 和 W10 这三个变体在热处理后的细胞中酶活性提高了 70%。通过 DNA Sanger 测序鉴定了这十个变体的突变，发现许多变体存在相同突变。例如 AA10、M10 和 T1 具有相同的 G72E 和 E365K 突变，M7 仅获得 E365K 这一个突变；W10 和 W20 具有相同的 L412W、Y416H 和 K436N 突变；B5 - 2 和 W21 具有相同的 M424T 突变。除 W21 在 tetO 操纵子获得额外突变可能转录增加蛋白表达外，其他变体在启动子区域均未发现突变。

进一步对表现最佳的两个变体 AA10 和 W10 在不同条件下的活性进行表征。为评估热稳定性，将纯化后的蛋白在 80°C 进行不同时间的热处理，然后在室温下检测酶活性。野生型酶活性保持稳定，AA10 热处理后活性略有增加，W10 则损失约 40% 的活性。同时评估变体在不同温度下的活性，随着温度从 20°C 升高到 90°C，所有酶的活性均快速上升。野生型 CelB 在该温度范围内活性稳步增加，而 AA10 和 W10 活性上升更快，在 80°C 左右达到平台期，低于野生型酶约 100°C 的最适温度。这表明 GCCDE 方法成功改变了这两个进化酶的最佳活性温度。虽然在 90°C 时，这两个变体与野生型酶活性相似，但在较低温度（30°C - 80°C）下，它们的活性显著更高。实验结果证明 GCCDE 方法有效地进化并筛选出了在保持热稳定性的同时，低温下酶活性增强的 CelB 变体。即使野生型 CelB 被认为在稳定性和灵活性方面已自然高度优化，研究仍能在一次进化实验中改造出具有所需性能的变体，凸显了该方法的强大和高效，也表明 GCCDE 在蛋白质工程中具有巨大潜力，即使对于被认为接近进化极限的蛋白质也能实现有效改造。

动力学研究和蛋白质结构分析

对 AA10 和 W10 进行酶动力学参数和突变研究，并与野生型 CelB 进行比较。结果显示，AA10 和 W10 的酶转换数 k_cat均提高了约 30%，且两个突变体对底物的结合亲和力增加，表现为更低的 K_m值。因此，在室温下，每个变体的整体催化效率（k_cat/K_m）比野生型提高了两倍以上。

通过氨基酸序列比对，发现 W10 变体在 C 末端区域有三个关键替换，即 L412W、Y416H 和 K436N，该区域包含多个保守的活性位点残基和亚基界面残基。利用 AlphaFold2 预测 W10 的三维结构并与野生型蛋白结构（PDB id：3APG）对比，发现 L412 被更大的色氨酸取代，靠近活性残基 W410，可能通过减小结合口袋大小促进底物结合；Y416H 替换可能诱导相邻活性残基 E417 和 W418 的空间位移，进而促进半乳糖结合和酶的催化效率；K436N 位于蛋白质外部靠近亚基接触区域，可能影响蛋白质整体热稳定性，将带正电的赖氨酸替换为不带电的天冬酰胺，预计会破坏与 G21、N53 和 F433 的氢键，还会改变参与界面相互作用和 CelB 同源四聚体形成的 R438 和 Y439 残基，这可能是 W10 变体在热处理下稳定性降低的原因。

AA10 变体包含 G72E 和 E365K 两个替换，虽然这两个突变不在催化活性位点内，但会导致二级结构改变，影响亚基间相互作用，而这种相互作用对底物进入和产物释放至关重要，这也解释了 AA10 在动力学研究中催化活性和底物结合亲和力增强的现象。72 位的甘氨酸在物种间高度保守，被带负电的谷氨酸取代后，会与 α15 螺旋上的 R448 产生静电吸引，且较大的谷氨酸残基可能引起局部口袋的空间位阻，改变附近 T452 和 D74 等残基的排列，导致 α15 螺旋和相邻环的构象发生显著重排；E365K 替换反转了该位置的电荷，可能诱导 α13 和 α14 螺旋的构象变化。这些螺旋结构的变化以及相邻螺旋、环和 β - 折叠的潜在改变，显著影响了酶的整体结构，增强了亚基间相互作用，稳定了四级结构，促进同源四聚体形成，改善了 CelB 的协同动力学和催化效率，最终提升了酶的性能。

结论

研究开发的生长偶联连续定向进化方法，实现了诱变、选择和富集的同步自动化。通过该方法，在一次进化实验中成功改造了嗜热酶 CelB，使其在较低温度下 β - 半乳糖苷酶活性增强的同时保持热稳定性。这一成果证明了 GCCDE 方法的有效性，它将遗传多样化、选择和富集整合在一个过程中，大幅减少了传统定向进化中 PCR、克隆和筛选所需的时间和精力。通过结合体外和体内诱变，扩大了遗传多样性，提升了进化结果。将酶活性与细胞生长偶联，实现了改进变体的高通量选择。借助连续培养系统和 MutaT7 平台，在单个生物反应器中实时高通量筛选 1.7×10?个细胞，实现了自动化酶工程。得到的 CelB 变体在室温下具有更高的 β - 半乳糖苷酶活性且热稳定性得以保留，还鉴定出可能在较低温度下改善底物结合并保持整体结构完整性的关键突变。GCCDE 方法广泛适用于任何可将活性与细胞生长联系起来的蛋白质工程，为高通量蛋白质优化和进化提供了强大的解决方案。

材料和方法

1. 菌株和生长条件：使用大肠杆菌 NEB 10 - beta 细胞进行质粒构建，大肠杆菌 JM109 细胞用于在 LB 培养基中进行蛋白质过表达，转化后使用 NEB SOC 生长培养基进行恢复。大肠杆菌 Dual7 菌株用于体内定向进化实验，该菌株缺乏天然 β - 半乳糖苷酶活性。实验使用两种培养基，乳糖最小培养基由 M63 培养基改良而来，含有乳糖、(NH?)₂SO?、KH?PO?、K?HPO?等多种成分，pH 调至 7.0 - 7.2；M63 - 葡萄糖培养基与乳糖最小培养基类似，只是将乳糖替换为葡萄糖。根据实验需求添加卡那霉素（50 μg/mL）。
2. 质粒构建和 CelB 文库制备：利用 NEB Builder HiFi DNA 组装试剂盒构建质粒，使用 NEB Q5 高保真聚合酶进行 PCR 反应。合成来自激烈热球菌（Pyrococcus furiosus）的 celB 基因并克隆到 pQE80 质粒中，对 pQE80 中的 T5 启动子进行修饰，将一个 lacO 序列替换为 tetO，并突变第二个 lacO，使其仅受 TetR 和 aTc 调控。将修饰后的 CelB 基因、工程化杂合启动子（P_tetO）和 TetR 基因组装构建成质粒 pDA381，再将 pDA381 的复制起点替换为 pSC101 Ori，构建出低拷贝数质粒 pDA386，pDA386 用于体内诱变和易错 PCR 模板。通过易错 PCR 针对 CelB 的催化区域（氨基酸 350 - 472）生成起始文库，反应体系包含特定浓度的模板 DNA、dNTP、MgCl?、MnCl?、NEB Taq 聚合酶和引物，经过特定 PCR 程序扩增后，产物经琼脂糖凝胶电泳验证、纯化，再组装到质粒中，转化到大肠杆菌 Dual7 细胞中，构建成 CelB 起始文库，文库在 SOC 培养基中恢复后，接种到含有卡那霉素和 aTc 的乳糖最小培养基中进行体内连续进化。
3. 生长偶联连续定向进化和选择：将上述制备的起始 CelB 文库培养物（共 17 mL）在 Chi.Bio 连续培养系统中 37°C 培养，当 OD₆₀₀达到 0.8 时，激活浊度恒定功能维持该 OD 值过夜，之后使用浊度恒定设置将 OD₆₀₀维持在 0.6（约 10? CFU/mL，通过 LB 平板活菌计数确定，处于对数中期），随着细菌生长自动补充新鲜培养基。进化实验持续 2 周，生物反应器中任何时刻约有 1.7×10?个细胞进行体内诱变。培养基中的乳糖激活 MutaT7 表达，驱动质粒上 T7 启动子下游 celB 基因的连续诱变，酶活性高的变体促进细菌更快生长，生长慢的细胞逐渐被洗出反应器。实验过程中逐渐将温度从 37°C 降至 27°C，筛选低温下 β - 半乳糖苷酶活性增强的 CelB 变体。进化实验结束后，立即向培养物中添加葡萄糖至终浓度 5 g/L 以停止 MutaT7 表达，然后在同一连续系统的 M63 - 葡萄糖培养基中培养 28 小时使突变稳定。
4. 筛选和测量 β - 半乳糖苷酶活性：将进化后的细胞稀释后涂布在含有 X - gal、aTc 和卡那霉素的 LB 琼脂平板上进行蓝白斑筛选，大约筛选 30 个平板，每个平板根据稀释因子含有 50 - 500 个菌落。挑选深蓝色菌落（代表高 β - 半乳糖苷酶活性）在含有 aTc 诱导的 LB 培养基中培养使 CelB 过表达，细胞洗涤后重悬于 PBS 缓冲液（pH 7.4）中，75°C 加热 15 分钟筛选耐热变体并裂解细胞，以便 CPRG 进入细胞进行酶活性测量，粗细胞裂解物样本进行 CPRG 测定。在 CPRG 测定中，CelB 水解 CPRG 释放氯酚红（CPR），使用酶标仪在 572 nm 处监测吸光度（A₅₇₂），CPRG 终浓度为 0.5 mM，测定体系中含有 2.7% 葡萄糖以筛选对葡萄糖抑制有耐受性的 β - 半乳糖苷酶变体，酶活性根据 CPR 生成曲线的斜率计算，定义为 A₅₇₂每分钟增加 0.001 吸光度单位，通过测量所有培养物的密度（OD₆₀₀）对酶活性进行归一化比较。
5. 蛋白质纯化和表征：将筛选出的 CelB 变体以 pDA381 为骨架克隆到带有 6×His 标签的高拷贝数质粒中，在大肠杆菌 JM109（DE3）中用 aTc（30 ng/mL）诱导过表达，使用 Ni - NTA 琼脂糖树脂纯化，通过 SDS - PAGE 分析评估纯化蛋白质的纯度和分子量，使用 BCA 测定法测定蛋白质浓度。使用上述 CPRG 测定法测量酶活性，利用经典的 Eadie - Hofstee 线性化图测定动力学参数 K_m和 k_cat。在热稳定性测试中，将蛋白质在 80°C 的热循环仪中孵育不同时间，然后在 25°C 进行 CPRG 测定。通过在不同温度下将纯化的酶与 CPRG 孵育 15 分钟，测量 572 nm 处的吸光度评估温度依赖性活性，