基于图像分析的氧化石墨烯纳米颗粒微生物还原稳健测量：开启微生物燃料电池优化新篇

《Applied and Environmental Microbiology》：Robust measurement of microbial reduction of graphene oxide nanoparticles using image analysis

本文聚焦于利用图像分析量化氧化石墨烯（GO）还原的研究。通过对比传统方法，发现图像分析在测量微生物（如 Shewanella oneidensis，S. oneidensis）对 GO 的还原时，误差更小、能揭示更多样本差异，为优化微生物燃料电池提供了更可靠的途径。

　　### 引言
Shewanella oneidensis（S. oneidensis）是一种在微生物燃料电池、污染物降解和纳米颗粒制备等领域应用广泛的细菌，其独特的电子转移能力使其能够利用多种细胞内和细胞外途径将电子传递给电子受体 。在微生物燃料电池中，S. oneidensis 的电子转移路径会根据电子受体的类型、环境条件等因素而变化，比如在不同的电子供体与受体比例、营养状况以及厌氧或好氧环境下，其主导的电子转移途径会有所不同。

传统的微生物燃料电池优化方法通常较为复杂且耗时，而模型还原测定法为快速优化反应条件提供了可能。目前用于监测 S. oneidensis 还原的模型测定方法，如亚甲基蓝、刚果红还原测定以及 ferrozine 测定等，在面对不溶性电子受体时存在局限性。相比之下，氧化石墨烯（GO）还原测定具有诸多优势，GO 在溶液中可形成尺寸范围从 1nm（胶体溶液）到 20μm（酸性或高浓度条件）的不溶性纳米颗粒絮凝物，其还原过程涉及 Mtr 呼吸途径，与微生物燃料电池中纳米颗粒或块状底物的还原过程相似，可作为理想的模型测定体系 。然而，GO 絮凝物会干扰传统的基于吸光度的测量技术，导致测量误差增加。

图像分析技术在纳米颗粒传感领域已得到广泛应用，通过对样本图像的分析，可以获取样本的颜色信息，进而推断出样本的性质变化。基于此，研究人员尝试将图像分析技术应用于 GO 还原测定，以克服传统测量方法的不足。

结果

1. 确定氧化石墨烯图像的平均色调、饱和度和值向量：研究人员编写了自定义 MatLab 代码，用于确定 GO 溶液图像的色调（H）、饱和度（S）和值（V）向量分布。在实验中，首先对样本图像进行裁剪，选取无眩光或反射的矩形感兴趣区域，然后在该区域内选择至少 12 个点，围绕每个点选取 32×32 像素的方框，计算方框内每个像素的平均值，从而得到每个感兴趣区域的平均 H、S、V 向量 。研究发现，选择 15 个点或更多时，可将各图像中所有选定点的标准误差降低至向量值的 0.09% 以下。
2. 平均 HSV 值与氧化石墨烯浓度的相关性：为探究图像分析测量 GO 还原的适用性，研究人员进行实验测定 HSV 值与 GO 浓度的相关性。结果显示，色调和饱和度向量与 GO 浓度并非线性变化，而是达到二元饱和点；而值向量在部分数据区域内与 GO 浓度呈线性关系，在较低 GO 浓度（6%-12%）范围内，增加 GO 浓度会导致样本平均 HSV 值降低，在 GO 浓度约 40%（0.40g/L）时达到平台期。因此，后续实验选用 6%-12% 的低浓度 GO，以充分利用图像分析的敏感性。
3. 新手用户对图像分析方法的应用：为评估图像分析技术的易用性，研究人员让无图像分析经验的用户从微生物 GO 反应的图像中选择能准确代表颜色的点，并计算 HSV 值。结果表明，不同用户选择的 HSV 值虽存在显著统计学差异（单因素方差分析 P<0.0001），但由于样本中 HSV 值向量的一致性，整体误差仅为 1.2%，这说明图像分析技术具有良好的可重复性，即使未经专业训练也能得到较为稳定的结果。
4. 图像分析与酶标仪吸光度测量的比较：酶标仪吸光度测量是目前测量细菌 GO 还原的标准方法，研究人员将图像分析方法与之对比。实验中，S. oneidensis 在有或无乳酸作为电子供体的条件下还原 GO，分别在特定时间点取样进行酶标仪分析和成像。结果显示，酶标仪测量中，含乳酸样本在初始滞后阶段后平均吸光度增加，表明 GO 被还原；不含乳酸或不含细菌的样本吸光度变化极小 。图像分析结果同样显示含乳酸样本的平均 HSV 值随时间增加，但滞后阶段更短。

进一步比较两种技术的检测限，发现酶标仪检测限更低，理论上更敏感；然而，图像分析数据的 W 比值（类似于 F 统计量）更高，表明其不同样本类型之间的统计差异更显著。通过自展分析（bootstrapping analysis）发现，图像分析能在更短时间内区分不同样本组，例如在比较含 0mM 乳酸、10mM 乳酸样本以及无细菌样本时，图像分析在 2.25 小时就能检测到含 0mM 乳酸和 10mM 乳酸样本的显著差异，而酶标仪需 5 小时 。此外，图像分析数据趋势线在 5 小时左右出现平台期，更符合细菌还原的 Gompertz 趋势，而酶标仪数据则未显示明显平台期，这些结果均表明图像分析技术具有更高的精度。
5. 不同初始细菌密度对测量的影响：细菌细胞和还原态 GO 的光密度吸光度峰可能重叠，从而影响 GO 还原的测量。研究人员通过实验探究不同初始 O.D.₆₀₀密度的细菌对酶标仪和图像分析测量 GO 还原的影响。实验中，为促进细菌生长，提供过量电子供体和营养物质，使用溶原肉汤（LB）作为电子供体来源 。结果显示，在 3.5 小时时，含细菌样本与对照样本外观差异明显，含细菌样本颜色更深。酶标仪测量数据的单因素方差分析 P 值为 0.0009，表明组间差异显著；图像分析数据的 P 值为 0.0814，整体组间差异不显著，但在比较个别样本时，两种分析方法都能检测到含细菌样本与对照样本的显著差异 。此外，酶标仪测量数据中，不同起始细菌密度样本的趋势线呈线性，而图像分析数据则有轻微平台期，酶标仪测量中样本差异可能是由细菌背景散射增加导致，而非还原活性增强，这再次体现了图像分析技术在复杂实验条件下的优势。
6. 图像分析对电活性缺陷菌株测量的准确性：为验证图像分析技术对不同电活性能力的 S. oneidensis 菌株的适用性，研究人员对电活性缺陷的 S. oneidensis 敲除菌株和野生型 MR-1 菌株进行 GO 还原实验，并对比图像分析和酶标仪分析结果。敲除菌株缺失影响外膜发色团的基因，预期其电活性会降低。实验中，在还原反应的中间时间点，野生型 MR-1 菌株的 GO 还原程度较高，颜色较深，而敲除菌株和无细菌对照样本颜色较浅 。通过非配对 t 检验发现，对于某些敲除菌株组合，酶标仪分析未检测到显著差异，而图像分析则能检测到，例如在比较 ΔmtrCΔomcAΔmtrF 和 ΔomcAΔmtrC 菌株时，图像分析的 P 值为 0.0160，表明两者存在显著差异，这说明图像分析测量更能准确反映这些电活性缺陷菌株的还原反应。
7. 放大规模氧化石墨烯还原反应的图像分析：为研究反应规模对微生物 GO 还原图像分析的影响，研究人员对体积从 1mL 到 200mL 的反应进行图像分析。结果发现，反应规模对还原速率有显著影响，1mL 样本还原速率最慢，为 0.024±0.001 单位 / 小时；10mL 和 200mL 样本还原速率相似，分别为 0.060±0.003 单位 / 小时和 0.063±0.003 单位 / 小时；40mL 样本还原速率最高，为 0.077±0.002 单位 / 小时，但与 200mL 样本相比，差异并不显著 。这表明图像分析技术能够测量反应体积相差 200 倍的样本中微生物对 GO 的还原速率，为研究不同规模反应提供了有效手段。

讨论

GO 还原测定有望作为 S. oneidensis 还原平台的模型测定方法，用于快速优化微生物还原平台，降低资源成本。然而，由于 S. oneidensis 存在多种还原途径，且主导途径受培养基成分和电子受体类型影响，因此选择合适的电子受体至关重要 。GO 虽适合作为模型测定的电子受体，但传统吸光度测定法因 GO 絮凝物的干扰难以准确测量其还原进程。

本研究对比了传统酶标仪吸光度测量和新型数字图像分析方法。在图像分析优化过程中，发现 HSV 值向量在特定 GO 浓度范围内与浓度呈线性相关，是监测 GO 浓度和还原程度的理想指标。不同用户应用图像分析技术的实验表明，该技术具有良好的一致性和可重复性，无需大量培训即可获得可靠结果。

与酶标仪测量相比，图像分析在测量细菌 GO 还原时具有诸多优势。首先，GO 絮凝物会沉降影响酶标仪读数，且 GO 吸收峰与细菌吸收峰存在重叠，干扰测量准确性；而图像分析通过分析图像颜色，不受光线透过样本的影响，也不易受细菌生长变化的干扰，能够更准确地测量不同样本间的差异 。其次，图像分析数据的趋势线更符合微生物还原的 Gompertz 模型，能更清晰地反映还原过程的不同阶段。此外，图像分析可分析更大体积的样本，适用于不同规模的实验，而酶标仪每次只能监测一个 24 孔微孔板，限制了样本分析数量。

在不同细菌浓度和不同菌株的实验中，图像分析技术同样表现出色。对于不同初始细菌密度的样本，图像分析能够有效避免细菌与 GO 吸光度光谱重叠带来的干扰；对于不同电活性的 S. oneidensis 菌株，图像分析能更准确地检测到还原活性的差异 。另外，图像分析技术成本较低，操作简便，使用智能手机即可进行图像采集，相比昂贵的酶标仪更具优势。综上所述，图像分析技术为 S. oneidensis 还原反应提供了一种可靠的模型测定方法，有望加速微生物燃料电池优化领域的发展。

材料和方法

1. 细菌菌株和培养：实验使用的细菌菌株包括 S. oneidensis MR-1（ATCC 700550）、S. oneidensis ΔomcAΔmtrC（JG749）、S. oneidensis ΔmtrDΔmtrCΔomcAΔmtrF（JG1101）和 S. oneidensis ΔmtrCΔomcAΔmtrF（JG596） 。细菌培养物从 - 80°C 保存于 25% 甘油的冷冻菌株中复苏，在 LB 培养基中培养。LB 培养基由胰蛋白胨（0.14M）、酵母提取物（15mM）和 NaCl（0.17M）溶解于去离子水制备，经高压灭菌后储存备用。将冷冻菌株划线接种到 LB 琼脂平板上，30°C 过夜培养，次日挑取单菌落接种到 5mL LB 培养基中，30°C、200rpm 振荡培养过夜，用于后续的 GO 还原实验。
2. 氧化石墨烯还原测定：按照文献方法制备最小培养基，向其中加入 GO（0.12g/L），将溶液分装到 40mL EPA vials 中，部分样本添加 DL - 乳酸（10mM）作为电子供体，用 10M 氢氧化钠调节 pH 至 7 。向每个 vial 中通入氮气 10 分钟以创造厌氧条件，然后按 1:100 的比例加入过夜培养的 S. oneidensis 菌液，设置三个不含细菌的样本作为阴性对照，30°C、200rpm 振荡培养。
3. 不同细菌光密度的氧化石墨烯还原测定比较：将 S. oneidensis 冷冻菌株划线接种到 LB 琼脂平板上，30°C 过夜培养，挑取单菌落接种到 LB 培养基中培养，使用 Thermo Fisher Scientific NanoDrop 每小时测量培养物的 O.D.₆₀₀ 。当培养物达到指数生长期（O.D.₆₀₀为 0.5）时，稀释菌液获得不同 O.D.₆₀₀值，将其加入到已通入氮气 10 分钟的含 GO（0.12g/L）的 LB 培养基中进行实验。
4. 酶标仪和图像数据的生成：在特定时间点，将样本置于光箱中，用 Google Pixel 手机拍照获取 RAW 图像文件，使用 Adobe Lightroom 将 RAW 文件转换为 JPEG 文件且不进行任何编辑，然后在 MATLAB 中对 JPEG 图像进行分析 。拍照后立即从每个样本中取 100-μL aliquots，放入 96 孔板中，使用 Biotek Synergy H1 酶标仪测量 610nm 处的光吸收值，以便直接对比数字图像分析和酶标仪吸光度测量对同一样本 GO 还原的测量结果。
5. 氧化石墨烯还原样本图像的颜色分析：对 GO 还原样本的 JPEG 图像进行进一步图像分析，获取不同时间点每个样本的 HSV 值向量平均值 。分析流程如下：首先选择并裁剪样本图像，选取背景或反射干扰最小的区域；在选定区域内至少选择 12 个点，避开反射区域；围绕每个点生成 32×32 像素的方框，将颜色数据用 HSV 颜色空间表示，HSV 颜色空间包含色调（H）、饱和度（S）和值（V）三个向量，其中 V 向量代表像素的明暗程度，取值范围为 0（最暗）到 1（最亮） 。分离 V 向量并计算整个方框内的平均值，再计算所有选定点的平均总体值，从而得到每个样本的平均值，并可计算样本中分析点的标准偏差。
6. 不同氧化石墨烯浓度的图像分析：为确定 V 向量与 GO 浓度的相关性，将不同百分比（0.1%-100%）的 GO 与 LB 培养基混合，在光箱中拍照后按上述方法进行数字图像分析，比较不同样本的平均 HSV 向量，观察 GO 浓度与向量测量值之间的关系。
7. S. oneidensis 电活性缺陷菌株对氧化石墨烯还原的分析：准备三个相同的 24 孔组织培养板，每个板中包含 S. oneidensis 敲除菌株 ΔmtrDΔmtrCΔomcAΔmtrF、ΔomcAΔmtrC、ΔmtrCΔomcAΔmtrF 或野生型菌株 MR-1 的三个重复样本 。每个样本孔中含有 1mL LB 培养基和 5%（0.05g）GO，接种 1:100 稀释的过夜细菌培养物，用光学透明胶带密封防止蒸发，30°C 培养。其中两个板用图像分析技术进行分析，一个板用 Biotek Synergy H1 酶标仪在 610nm 处测量吸光度，持续测量 26 小时。
8. 不同规模氧化石墨烯还原的图像分析：将 MR-1 过夜培养物按 1:100 的比例接种到含 5% GO（1g/L）的 LB 培养基中，分别使用 1mL、10mL、40mL 或 200mL 体积的培养基，在 24 孔组织培养板、40-mL EPA vials、50-mL 离心管或 250-mL 培养基瓶中 30°C 培养 。使用 Miroco SAD 灯在光箱中进行成像，以确保均匀照明，计算三个重复样本的标准偏差作为误差。
9. 不同用户对图像分析方法的应用：邀请六位无图像分析经验的用户，让他们从之前实验中 3.5 小时时间点的 40-mL 离心管图像中选择能准确代表颜色的区域，然后在所选区域内选择 10 个或更多能准确代表颜色的点，不提供其他指导 。计算每个用户所选点的 HSV 值，并确定每个用户点的中位数 HSV 值。
10. 数据趋势的统计分析：使用 GraphPad Prism 进行分析以获得 P 值，采用 ANOVA 检验并进行 Welch 校正，以获得不同样本趋势之间的统计差异 。自展分析按照 B. Efron 和 R. Tibshirani（1993）的方法进行，通过多次随机抽样计算检验统计量，重复 1,000,000 次以估计 P 值，该方法适用于从较小数据集估计 P 值。