NAT10 与 ac4C：抑制 R 环水平及炎症反应的关键 “卫士”

《SCIENCE ADVANCES》：NAT10 and N4-acetylcytidine restrain R-loop levels and related inflammatory responses

在生命科学研究中，N4- 乙酰胞苷（ac4C）与 N - 乙酰转移酶 10（NAT10）的作用机制尚不明确。研究人员围绕二者展开研究，发现 NAT10 依赖的 ac4C 乙酰化在 rRNA 和特定 tRNA 中显著，且 NAT10 可抑制 R 环水平及相关炎症反应，为相关疾病研究提供新方向。

　　在生命科学的微观世界里，细胞的正常运作依赖于众多精细的调控机制，其中生物分子的乙酰化修饰便是极为关键的一环。N - 乙酰转移酶 10（NAT10）作为负责蛋白质和 RNA 乙酰化的重要酶，在哺乳动物细胞中扮演着不可或缺的角色。它能将乙酰基引入胞嘧啶（C）的 N⁴位置，形成 N⁴- 乙酰胞苷（ac⁴C） 。这一修饰在转运 RNA（tRNA）和核糖体 RNA（rRNA）中较为常见，然而其在 mRNA 中的普遍性却存在争议。

同时，NAT10 与衰老和癌症也有着千丝万缕的联系。在衰老方面，抑制或减少 NAT10 可改善由早老症（Hutchinson Gilford progeria syndrome，HGPS）导致的细胞异常核形态，延长相关小鼠模型的健康寿命；在癌症领域，NAT10 在多种癌症（如肝癌）中呈上调状态。但由于缺乏有效分析 RNA ac⁴C 乙酰化的方法，其在 NAT10 衰老和癌症相关功能中的生物学意义仍扑朔迷离。

为了揭开这些谜团，来自国外研究机构的研究人员开展了一系列深入研究。相关研究成果发表在《SCIENCE ADVANCES》上，为我们理解细胞调控机制以及相关疾病的发生发展提供了新的视角和理论依据。

研究人员在本次研究中采用了多种关键技术方法。在检测 RNA 的 ac⁴C 位点时，运用了改良的氰基硼氢化钠（NaCNBH₃）化学处理结合下一代测序技术，包括热稳定 II 型内含子逆转录酶测序（TGIRT-seq）和全转录组 RNA 测序（RNA-seq） 。在研究 R 环相关机制时，使用了 RNA/DNA 杂交 S9.6 小鼠单克隆抗体进行斑点印迹（dot blot）实验、DNA-RNA 免疫沉淀测序（DRIP-seq） 。此外，还通过免疫荧光（IF）实验来检测 ac⁴C RNA 的细胞定位。

在探索 ac⁴C 位点的研究中，研究人员利用 NaCNBH₃-seq 技术对 HeLa 野生型（WT）和 NAT10 基因敲除（KO）细胞的 RNA 进行处理和测序。结果发现，在 tRNA 和 rRNA 中能够准确识别出已知的 ac⁴C 位点，如 tRNA^Ser和 tRNA^Leu的第 12 位以及 18S rRNA 的 C1337 和 C1842 位点 。然而，在 mRNA 中却未检测到具有统计学意义的 ac⁴C 位点。

关于 NAT10 对 R 环水平的调控作用，研究人员通过对数据的深入分析发现，NAT10-KO 细胞中出现了更多的 C→T 错配，且这些错配大多发生在 NAT10 的共有序列内，同时与 R 环区域存在重叠。通过 dot blot 和 DRIP-seq 实验进一步验证，结果表明 NAT10-KO 虽未显著影响全局 R 环水平，但却大幅增加了差异表达基因（DEGs）中 R 环阳性基因的 R 环水平，这意味着 NAT10 可能参与了 R 环的分解过程。

在探究 NAT10 对 R 环的乙酰化及分解作用机制时，研究人员使用 ac⁴C 抗体进行 dot blot 实验，发现 HeLa WT 细胞中 R 环的 RNA 部分可被 NAT10 乙酰化，且这种乙酰化作用在 NAT10-KO 细胞中显著降低。通过构建可诱导表达 NAT10-FLAG 的细胞系并进行 DRIP-seq 实验，研究人员发现过表达野生型 NAT10（NAT10f-WT）可降低 R 环阳性 DEGs 的 R 环水平，而催化突变体 NAT10f-R628A 则无此效果，这充分证明了 NAT10 的催化活性在 R 环分解中起着关键作用。

利用 ac⁴C 抗体进行 IF 实验，研究人员发现 HeLa WT 细胞中存在大量由 NAT10 依赖的乙酰化 RNA 形成的荧光焦点，这些焦点主要定位于细胞质中的内体结构，且与内体标记物 Ras 相关蛋白 RAB5 等存在共定位现象。进一步研究发现，过表达 RNase H1 可增加 ac⁴C 焦点的数量，这表明部分 ac⁴C 焦点可能来源于 R 环衍生的 RNA。

对 HeLa WT 和 NAT10-KO 细胞进行 RNA-seq 分析，并利用 Ingenuity Pathway Analysis（IPA）工具进行预测，结果显示 NAT10-KO 可诱导炎症相关基因的表达，激活 TLR7 相关通路。研究人员通过实验证实，NAT10-KO 细胞中 TLR7 水平显著升高，其下游标志物 TANK 结合激酶 1（TBK1）磷酸化增强。此外，研究还发现 R 环衍生的 RNA 可能是激活 TLR7 的关键因素，在 NAT10-KO 细胞中，由于 R 环水平升高且缺乏乙酰化修饰，从而导致 TLR7 激活和炎症反应发生。

综合上述研究结果，研究人员揭示了 NAT10 和 ac⁴C 在调控 R 环水平和炎症反应中的重要作用。NAT10 通过其催化活性乙酰化 R 环的 RNA 部分，促进 R 环的分解，减少 R 环衍生 RNA 引发的炎症反应。这一研究成果不仅为深入理解细胞内 RNA 修饰和基因表达调控机制提供了重要依据，还为衰老、癌症以及炎症相关疾病的研究开辟了新的方向。未来，针对 NAT10 和 ac⁴C 的进一步研究有望为这些疾病的诊断和治疗提供新的靶点和策略。