HMCES 如何 “捣乱”：同源重组缺陷细胞中碱基切除修复时的复制叉稳定性破坏机制

《SCIENCE ADVANCES》：HMCES corrupts replication fork stability during base excision repair in homologous recombination–deficient cells

在研究同源重组缺陷（HRD）细胞中受损碱基修复相关问题时，研究人员开展了 HMCES 对复制叉稳定性影响的研究。结果发现 HMCES-DPCs 会造成 HRD 细胞中复制叉缺陷等问题，这揭示了内源性 DPCs 对 HRD 肿瘤基因组稳定性的影响，为相关研究提供新方向。

　　在细胞的生命活动中，DNA 时刻面临着各种威胁。化学或物理因素对 DNA 碱基的修饰，以及尿嘧啶等错误掺入，就像一群 “捣乱分子”，频繁地制造出 DNA 损伤，这些损伤出现的频率高达 1×10⁵ 至 5×10⁵ 次 / 细胞 / 天。在修复这些损伤的过程中，会产生无嘌呤 / 无嘧啶（AP）位点和单链断裂（SSB），它们就像道路上的 “路障”，阻碍着复制叉的前进，威胁着基因组的稳定性。尤其在同源重组缺陷（HRD）细胞中，这些 “路障” 带来的问题更为严重，它们与 HRD 肿瘤对聚（腺苷二磷酸 - 核糖）聚合酶（PARP）抑制剂的敏感性密切相关，但其中的分子机制却一直是个未解之谜。

为了揭开这个谜团，来自国外的研究人员展开了深入研究。他们发现，5 - 羟甲基 - 2'- 脱氧胞苷（5hmdC）在细胞内会 “变身” 为 5 - 羟甲基 - 2'- 脱氧尿苷（5hmdU），这一转变会给 HRD 细胞带来大麻烦，导致基因组不稳定。进一步研究发现，单链选择性单功能尿嘧啶 DNA 糖基化酶（SMUG1）和 AP 核酸内切酶 1/2（APEX1/2）在处理 5hmdU 时，会协同作用产生 ssDNA 缺口，这些缺口就像一个个 “小陷阱”，严重影响了复制叉的正常行进。

而 5hmdU 衍生的 ssDNA 缺口如果不能及时有效地修复，会在 HRD 细胞中持续存在并积累，这不仅会加剧基因组的不稳定性，还会导致细胞死亡。研究人员还发现了一个关键 “角色”——5 - 羟甲基胞嘧啶结合、胚胎干细胞特异性蛋白（HMCES），它与 AP 位点结合形成的 HMCES - DNA - 蛋白质交联（HMCES - DPCs），竟然是造成 5hmdC 介导的 ssDNA 缺口的 “罪魁祸首”。在 HRD 细胞中，HMCES - DPCs 的积累会严重破坏复制叉的稳定性，引发染色体畸变，最终导致细胞走向死亡。此外，研究还发现引物酶 - 聚合酶（PRIMPOL）也参与了 5hmdC 介导的 ssDNA 缺口的形成过程，它介导的 ssDNA 缺口与 HMCES - DPCs 相互关联，共同影响着细胞的命运。

该研究成果发表在《SCIENCE ADVANCES》上，为深入理解 HRD 细胞中 DNA 损伤修复机制提供了重要依据，也为 HRD 肿瘤的治疗提供了新的潜在靶点和理论支持。

在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。他们利用细胞系实验，包括野生型和 Fancd2^?/?小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）、BRCA2^?/?的 DLD - 1 细胞等，观察不同处理条件下细胞的变化。采用免疫荧光显微镜技术，直观地观察细胞内相关蛋白的表达和定位情况。通过碱性彗星试验、DNA 纤维试验等检测 DNA 损伤和复制叉的状态。还运用 CRISPR - Cas9 技术对特定基因进行编辑，探究基因功能。同时，借助生存分析，分析 HMCES 表达与患者预后的关系。

下面详细来看研究结果：

• 5hmdU 的错误掺入导致 HRD 细胞基因组不稳定：研究人员通过对 Fancd2^?/?小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的研究发现，5hmdC 处理后，敲低参与嘧啶补救途径的脱氧胞苷激酶（DCK）或 2'- 脱氧胞苷 5'- 单磷酸脱氨酶（DCTD），可以显著抑制 5hmdC 介导的细胞致死性，而野生型细胞不受影响，这表明 5hmdC 脱氨生成 5hmdU 是导致 HRD 细胞毒性的关键。进一步研究发现，5hmdC 处理后，Fancd2^?/?细胞中核 PARylation 水平显著升高，EdU - PAR 焦点增多，单链断裂（SSBs）增加，复制叉不对称性增强，姐妹染色单体交换（SCEs）增多，这些都表明 5hmdU 错误掺入导致了 ssDNA 缺口积累，进而引发了 HRD 细胞的基因组不稳定。
• SMUG1 和 APEX1/2 协同作用影响复制叉进程：SMUG1 作为主要负责从基因组 DNA 中去除 5hmdU 的 DNA 糖基化酶，研究发现，在 5hmdC 处理的 Fancd2^?/?细胞中，敲低 SMUG1 可以显著降低核 PARylation 水平，减少 EdU - PAR 焦点，消除 5hmdC 诱导的 SSBs，恢复复制叉进程和细胞活力，这表明 SMUG1 在 5hmdC 诱导的 ssDNA 缺口形成中起着关键作用。同样，敲低 APEX1 或 APEX2 也能显著降低 5hmdC 处理的 Fancd2^?/?细胞中的核 PARylation 水平、EdU - PAR 焦点和 SSBs，且 APEX1 和 APEX2 在处理 5hmdU 衍生的 AP 位点时具有协同作用，共同影响着复制叉的稳定性。
• 5hmdU 衍生的 ssDNA 缺口加剧 HRD 细胞的基因组不稳定和致死性：研究发现，在 5hmdC 处理的 Fancd2^?/?细胞中，敲低 XRCC1 会进一步增加核 PARylation 水平和 EdU - PAR 焦点，加剧细胞致死性，但对复制叉损伤影响不大，这表明在缺乏 FANCD2 的情况下，复制叉相关的 ssDNA 缺口会在 XRCC1 缺失时持续存在或积累。此外，5hmdC 处理会显著增加 Fancd2^?/?细胞中的 SCEs，敲低 SMUG1 或 APEX1 可以抑制这种增加，而敲低 PARP1 或 XRCC1 则会加剧 SCEs，这说明 5hmdC 介导的新生链中的 ssDNA 缺口是 HRD 细胞中 SCEs 的重要来源，缺陷性的修复会导致基因组不稳定和细胞死亡。
• HMCES - DPCs 是 HRD 细胞中 5hmdC 介导的 ssDNA 缺口的重要原因：研究发现，Fancd2^?/?细胞中染色质结合的 HMCES 水平明显高于野生型细胞，且在 5hmdC 处理后呈剂量依赖性增加。敲低 HMCES 可以显著降低 5hmdC 诱导的核 PARylation 水平、EdU - PAR 焦点和 SSBs，恢复 Fancd2^?/?细胞的复制叉进程、对称性和细胞活力，减少染色体畸变，这表明 HMCES - DPCs 是 5hmdC 诱导的 ssDNA 缺口的重要来源，对 HRD 细胞的复制叉稳定性、染色体稳定性和细胞存活具有重要影响。同时，研究还发现 HMCES、APEX1 和 APEX2 在处理 5hmdU 的过程中处于同一遗传通路。
• PRIMPOL 介导部分 5hmdC 介导的 ssDNA 缺口：研究表明，PRIMPOL 敲低可以部分抑制 5hmdC 介导的 PARylation、EdU - PAR 焦点和 ssDNA 缺口的形成，但不能完全消除，这说明 5hmdC 诱导的 ssDNA 缺口中有一部分依赖于 PRIMPOL。同时，HMCES 和 PRIMPOL 在调节 5hmdC 诱导的 SCEs 中具有上位性效应，表明 5hmdC 诱导的 HMCES - DPCs 会触发 PRIMPOL 依赖的 ssDNA 缺口形成，进而导致 SCEs 增加。

研究结论和讨论部分指出，本研究揭示了 HMCES - DPCs 在 HRD 细胞中对复制叉稳定性的破坏作用，明确了其是导致复制后 ssDNA 缺口积累的重要因素。研究还发现了两种 ssDNA 缺口的来源，一种与 APEX1/2 对 HMCES - DPC 的切割有关，另一种依赖于 APEX1 和 PRIMPOL 的共同作用。此外，研究人员通过对乳腺癌患者队列的分析发现，HMCES 低表达与患者生存率降低相关，这表明 HMCES 可能是 HRD 癌症易感性的有用生物标志物。然而，目前仍有许多问题有待进一步研究，例如在 HRD 细胞中，RAD51 等蛋白如何促进链入侵和 SCEs 的完成，HMCES - DPCs 对肿瘤发生的具体影响机制等。本研究为深入理解 HRD 细胞的生物学特性和 HRD 肿瘤的治疗提供了重要的理论基础，也为后续研究指明了方向。