《Nature Microbiology》可诱导转座子突变测序技术突破宿主瓶颈：揭示细菌感染小鼠过程中的适应性决定因素

《Nature Microbiology》：Inducible transposon mutagenesis identifies bacterial fitness determinants during infection in mice

传统Tn-seq技术因转座子递送效率低和群体瓶颈效应限制了其在动物模型中的应用。哈佛医学院David W. Basta团队开发了"InducTn-seq"技术，通过阿拉伯糖诱导的Tn5转座酶实现时空可控突变，在单克隆中产生超百万突变体。应用该技术于Citrobacter rodentium小鼠结肠炎模型，克服了传统方法仅能回收10-102个突变体的限制，首次发现I-E型CRISPR系统通过抑制隐蔽毒素维持肠道定植。该研究发表于《Nature Microbiology》，为细菌基因组规模正向遗传筛选提供了突破性工具。

　　

在微生物学研究领域，解析细菌在感染过程中的遗传适应性决定因素一直是重大挑战。传统转座子插入测序技术（Transposon insertion sequencing, Tn-seq）虽然能进行基因组规模的正向遗传筛选，但受到转座子递送效率低和群体瓶颈效应的严重限制。特别是在动物感染模型中，起始感染细菌数量常低于10³个细胞，导致大部分突变体因随机漂变而非选择压力被淘汰。这种技术瓶颈阻碍了研究人员全面理解细菌在真实感染环境中的生存策略。

为突破这一技术壁垒，哈佛医学院和布莱根妇女医院的研究团队Matthew K. Waldor课题组开发了创新性的"InducTn-seq"（可诱导转座子测序）技术。该研究通过构建阿拉伯糖诱导的Tn5转座酶系统，实现了细菌突变群体的时空可控性，成功在《Nature Microbiology》发表了题为"Inducible transposon mutagenesis identifies bacterial fitness determinants during infection in mice"的重要研究成果。

研究团队采用了几个关键技术方法：1）构建含PBAD启动子调控Tn5转posase的attTn7位点整合系统；2）开发基于Cre重组酶的转位频率指示器；3）建立体外和体内（C57BL/6J小鼠）诱导突变体系；4）应用全基因组测序和生物信息学分析定量突变体适应性；5）通过基因敲除和互补实验验证CRISPR相关发现。

研究结果部分，"设计可诱导突变系统"显示，阿拉伯糖诱导使大肠杆菌MG1655转位频率提高43倍，28%细胞产生突变。单克隆扩增后检测到3.5×10⁵个独特插入位点，远超传统方法。"高密度插入突变"证实诱导条件下必需基因（如obgE、rpmA）与非必需基因插入频率相当，突破了传统Tn-seq的检测局限。"敏感突变体适应性分析框架"显示该方法能识别248个已知必需基因，且对短AT富集区假阳性更低。

"单克隆产生高多样性突变群体"部分证明InducTn-seq在四种病原体（包括C. rodentium）中均能产生10⁵-10⁶个突变体。"克服宿主瓶颈"的实验显示，小鼠饮用水中添加阿拉伯糖使突变频率提高4倍，回收>5×10⁵个独特突变体，而传统Tn-seq仅10-10²个。"鉴定C. rodentium定植因子"发现LEE致病岛、氨基酸合成和厌氧代谢相关基因的关键作用，同时揭示肠杆菌素摄取系统在体内外呈现相反选择压力。

最引人注目的发现出现在"CRISPR抑制的毒素在感染中激活"部分。研究首次在C. rodentium的cas3-casA间隔区鉴定出96bp的隐蔽毒素（CreT），其表达受Cascade复合物（CasABCDE）和crRNA样抗毒素（CreA）调控。当CasD缺失时，毒素激活导致定植缺陷，而整个CRISPR位点缺失反而恢复定植能力，证实了I-E型CRISPR系统通过"成瘾"机制维持自身完整性的新策略。

这项研究具有多重重要意义：技术上，InducTn-seq解决了细菌遗传学研究中长期存在的群体瓶颈问题，使动物感染模型的基因组规模筛选成为可能；理论上，揭示了CRISPR系统除抗噬菌体防御外的全新生物学功能；应用上，为理解肠道病原体的定植机制提供了新视角。特别是发现的CRISPR相关毒素-抗毒素系统，可能代表了一类新型的细菌基因调控模块，为抗菌药物开发提供了潜在靶点。该研究将细菌遗传学分析推向了新的高度，为感染生物学研究树立了技术标杆。