人源视锥光感受器移植：晚期莱伯先天性黑蒙症（LCA）治疗新希望

本文研究了人源多能干细胞衍生的视锥光感受器（hCones）移植治疗莱伯先天性黑蒙症（LCA）的 AIPL1?/?小鼠模型的效果。结果表明，hCones 能功能性整合，促使视网膜重塑，恢复视觉功能，为 LCA 等视网膜疾病治疗带来新希望。

　　### 研究背景
视网膜变性晚期，患者光感受器细胞近乎完全丧失，导致失明，目前针对这种晚期疾病的治疗手段有限。基因补充疗法虽能治疗部分小鼠视网膜变性模型，但治疗窗口期短，且多数基因疗法具有基因特异性。此外，电植入物和光遗传学方法也存在局限性。光感受器替代疗法作为一种生理途径，有望治疗光感受器丧失后的早发性和 / 或严重疾病。此前研究显示，人源多能干细胞衍生的视锥光感受器（hCones）可在视杆 - 视锥营养不良的 Rd1 小鼠模型中挽救视网膜功能，但尚不清楚该疗法在其他严重视网膜变性疾病中的效果。

研究目的

本研究旨在探究 hCones 移植能否在莱伯先天性黑蒙症（LCA）的 AIPL1^?/?/FoxN1^nu小鼠模型中实现有意义的功能挽救，以支持光感受器替代疗法的广泛适用性。

实验方法

1. 动物模型：使用 AIPL1^?/?、AIPL1^?/?/FoxN1^nu/nu、Gnat1^?/?和 C57Bl/6 野生型（WT）小鼠，所有动物实验均遵循相关法规和政策。
2. 细胞来源与移植：将人 H9 胚胎干细胞（ESC）诱导分化为视网膜器官 oid，转导 ShH10.2.1L/M - Opsin.GFP 病毒，筛选出 GFP + hCones，在 3 月龄免疫缺陷的 AIPL1^?/?小鼠眼内进行视网膜下移植，每眼移植 500,000 个 hCones。
3. 检测方法
   • 组织学和免疫组化：对小鼠视网膜进行免疫组化染色，使用多种抗体标记不同细胞类型和蛋白，通过共聚焦显微镜成像观察视网膜细胞和蛋白表达情况。
   • 细胞定量分析：选取视网膜特定区域拍照，随机选择细胞测量核大小，对特定细胞类型进行计数。
   • 视网膜和视觉功能测试：采用 OptoDrum 系统评估小鼠的视动反应，检测视觉敏锐度；使用 Celeris ERG 系统进行全视野视网膜电图（ERG）记录；通过多电极阵列（MEA）记录视网膜神经节细胞层（GCL）的微视网膜电图（mERG）和多单元（MU）放电活动；运用离线分选器（Offline Sorter）和自定义 MATLAB 代码对神经元波形进行处理和分类，分析神经元反应。
   
   

实验结果

1. AIPL1^?/?小鼠视网膜光感受器丧失及内层视网膜重塑
   • 光感受器退化：3 月龄 AIPL1^?/?小鼠中央视网膜的视杆和视锥光感受器几乎完全退化，仅周边偶见极少量视锥光感受器细胞体，且无明显外段结构。
   • 内层视网膜神经元变化：蛋白激酶 Cα（PKCα）和分泌粒蛋白（SCGN）标记的双极细胞（BCs）树突显著回缩，但轴突投射和突触小体保留；钙结合蛋白（Calbindin）标记的水平细胞（HCs）树突回缩，部分细胞体位置翻转；无长突细胞（ACs）和视网膜神经节细胞（RGCs）在 3 月龄时 Calretinin 标记的分层结构尚清晰，6 月龄时开始瓦解；Müller 胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白（Gfap）表达上调，呈现广泛的反应性胶质增生。
   • 突触蛋白表达改变：突触前蛋白 Ribeye 在 3 月龄 AIPL1^?/?小鼠视网膜中几乎检测不到，突触后受体 mGluR6 表达下调且重新定位到 BCs 细胞体。
   
   
2. 移植的 hCones 在 AIPL1^?/?宿主视网膜中的存活、成熟及与宿主细胞的相互作用
   • hCones 存活与成熟：移植 3 个月后，L/M - Opsin.GFP + hCones 存活良好，在宿主内层核层（INL）附近形成厚度可变的细胞层，平均覆盖面积约 2.48mm²。通过检测人核抗原（HNA）和人特异性视锥 Arrestin（hCAR）等，证实这些细胞为人源，且许多细胞表达外周蛋白 2（PRPH2），提示其具有新生外段结构。
   • 宿主内层视网膜重塑：PKCα + ON BCs 和 SCGN + 视锥 BCs 均重新延伸树突至 hCones 细胞团，部分 PKCα + 细胞体迁移至细胞团内；Calbindin + HCs 树突也发生延伸，而 Calretinin + ACs 和 RGCs 与对照组相比变化不大。Gfap + Müller 胶质细胞突起延伸至 hCones 细胞团，将其整合到宿主神经视网膜结构中。
   • 突触形成：在 hCones 细胞团中观察到 RIBEYE 的点状标记，SCGN + 和 PKCα + BCs 广泛重新表达 mGluR6，二者存在假定的突触接触点，3D 重建显示存在轴 - 体、树 - 体和轴 - 树突等多种接触方式。
   
   
3. 移植 hCones 对 AIPL1^?/?小鼠视觉功能的影响
   • ERG 检测结果：移植 3 个月后，接受 hCones 移植的 AIPL1^?/?小鼠与未注射的对照组一样，在全视野明视闪光 ERG 记录中未检测到可重复的测量反应，表明移植的 hCones 不足以驱动小鼠产生可重复的全视野 ERG 反应。
   • 视动反应：6 月龄（移植后 3 个月）的 AIPL1^?/?小鼠，部分接受 hCones 移植的眼睛可测量到视觉阈值，与未注射的眼睛相比，视力阈值存在显著差异，说明移植 hCones 可恢复部分视动头跟踪行为。
   • MEA 检测结果：未治疗的 AIPL1^?/?视网膜对光刺激无明显 mERG 反应和放电率变化；Gnat1^?/?视网膜对光刺激有大振幅 mERG 反应和多样的 MU 放电反应；hCones 移植的 AIPL1^?/?视网膜在移植细胞团下方电极处产生强大且可重复的 mERG 反应，MU 放电率也有快速瞬态增加，且与刺激的开始和 / 或结束时间锁定。
   
   
4. 视觉反应的感觉特征
   • 光响应单元比例：hCones 移植的 AIPL1^?/?视网膜中光响应单元比例（53.4% ± 9.9%）显著高于未治疗的 AIPL1^?/?视网膜（3.7% ± 0.7%），但低于 Gnat1^?/?视网膜（88.5% ± 2.0%）。
   • 反应类型分布：移植视网膜中 ON 反应比例（65%）高于 Gnat1^?/?对照组（23%），ON - OFF 反应比例（21%）低于对照组（61%），OFF - only 反应比例在两组中相似（分别为 10% 和 11%）。
   • 反应幅度和潜伏期：移植视网膜的 ON 和 OFF 反应平均幅度均显著低于 Gnat1^?/?对照组，但峰值反应潜伏期与对照组相似，表明视觉信息从移植的 hCones 传递到宿主 RGCs 的时间在正常范围内。
   
   
5. 光诱发 RGC 反应的机制：应用突触阻滞剂（L - 2 - 氨基 - 4 - 膦酰丁酸，L - AP4；6,7 - 二硝基喹喔啉 - 2,3 - 二酮，DNQX；D - 2 - 氨基 - 5 - 膦酰戊酸，D - AP5）后，hCones 移植视网膜和 Gnat1^?/?视网膜的 mERG 和所有快速瞬态光反应均消失，证实光诱发反应通过 hCones 的谷氨酸能传递介导。
6. 不同光照水平下的视觉反应：在不同光照强度下刺激移植视网膜，发现其在较宽光照范围内有显著的峰值放电率变化，类似 Gnat1^?/?视网膜。在 10¹⁴ photons/cm²/s 以下，移植视网膜的反应与 Gnat1^?/?视网膜相似，之后反应变化减小。随着光照强度增加，a 波、b 波振幅和 RGC 放电率均增加，表明供体 hCones 能编码光信息，宿主 BCs 和 RGCs 可传递视觉信息。

研究结论

本研究表明，在 AIPL1^?/?这种严重的 LCA 小鼠模型中，hCones 移植后能在宿主视网膜中存活、成熟，并与宿主内层视网膜神经元形成新连接，促进视网膜重塑，恢复视觉功能。尽管移植视网膜的功能尚未完全恢复到正常水平，但在正常环境光水平下已实现一定程度的视网膜和视觉功能恢复。这些结果为光感受器替代疗法治疗晚期视网膜变性疾病提供了有力支持，表明该疗法是一种可行的、具有疾病通用性的潜在治疗策略，为未来视网膜疾病的治疗带来了新的希望。未来研究可进一步优化移植方案，探索其长期效果和安全性，以及如何更好地促进移植细胞与宿主视网膜的整合，以提高治疗效果。