靶向降解 CDK9：打破 MYC 调控网络，开启癌症治疗新希望

本文聚焦 CDK9 与 MYC 调控网络在癌症中的关键作用。研究人员开发出选择性 CDK9 PROTAC 降解剂（KI-CDK9d-32），发现其能快速下调 MYC，避免传统抑制 CDK9 导致的补偿性增加，还可破坏核仁稳态。这为 CDK9 靶向治疗癌症提供了新策略。

　　

研究背景

1. MYC 与癌症：MYC 基因表达是促进细胞增殖的刺激信号通路的重要标志。其表达失调，如因基因组扩增或基因拷贝数增加等多种基因组改变，是癌症发展和进展的关键驱动因素。因此，抑制 MYC 转录及其下游程序一直是癌症治疗开发的重要目标。
2. CDK9 在 MYC 调控中的作用：CDK9 作为正转录延伸因子 b（P-TEFb）的催化亚基，对 MYC 的调控至关重要。MYC 基因表达高度依赖 CDK9，CDK9 通过 P-TEFb 复合物与 BRD4 相互作用，在某些细胞环境中还借助 ERK 蛋白的支架活性，与 MYC 启动子结合。同时，CDK9 介导的 MYC 丝氨酸 62 磷酸化可保护该癌蛋白不被降解。所以，MYC 基因组扩增会增加对 CDK9 的依赖，CDK9 成为维持 MYC 成瘾肿瘤状态的关键因素。
3. CDK9 抑制剂的困境：超过二十种 CDK9 抑制剂已在涉及血液肿瘤和实体瘤的临床试验中进行评估，但由于脱靶和靶上毒性以及缺乏客观反应，这些药物尚未获得 FDA 批准。持续抑制 CDK9 会诱导 MYC 表达的补偿性增加，这种耐药机制被认为是由溴结构域蛋白 BRD4 激活细胞内无活性的 CDK9，并将其引导至 MYC 启动子所致。
4. 靶向蛋白降解的兴起：靶向蛋白降解技术的发展为研究 CDK9 生物学和开发治疗方法带来了新机遇。与传统抑制剂不同，降解剂能抑制靶蛋白的酶活性和支架功能，可能避免补偿或激酶组重排。近年来已有多种 CDK9 降解剂被报道，它们在降解选择性上优于其前体抑制剂。

实验设计

1. 设计并合成 CDK9 PROTACs：研究人员以超选择性 CDK9 抑制剂 KI-ARv-03 为基础，设计并合成了一系列 CDK9 PROTACs。利用小分子微阵列（SMM）平台发现的 KI-ARv-03，其分子内的伯胺用于连接接头，以泊马度胺为招募泛素连接酶 cereblon（CRBN）的元件，构建了初始的双价降解剂文库。
2. 筛选和优化降解剂：在 MOLT-4 细胞（一种依赖 MYC 且 CDK9 是已知治疗靶点的 T 淋巴母细胞系）中评估这些化合物降低 CDK9 蛋白水平的潜力。经筛选，化合物 KI-CDK9d-08 表现突出，后续以其为支架进行优化。采用接头优化和 IMiD 替代等策略，设计出第二代降解剂，最终选择 KI-CDK9d-32 作为深入研究的候选化合物。
3. 综合评估降解剂效果：运用转录组学、蛋白质组学、磷酸蛋白质组学和成像等多种方法，全面表征 CDK9 降解的下游效应和细胞适应性变化。同时进行细胞活力评估、高通量细胞敏感性分析等实验，探究不同细胞系对 KI-CDK9d-32 的反应差异及相关生物标志物。

实验结果

1. KI-CDK9d-32 的降解特性：KI-CDK9d-32 是一种高效且具有快速动力学的 CDK9 降解剂。在 MOLT-4 细胞中，4 小时处理后，它能实现近 100% 的 CDK9 降解，DC₅₀为 0.89 nM。其降解效率符合 “钩效应”，在较低浓度下，降解效率随浓度增加而提高，在 126 nM 时达到最快降解速率 1.04 h^-1，超过一定浓度（如 355 nM），降解效率会因 “钩效应” 而受限，但随着处理时间延长，这种限制逐渐减弱。
2. 对 MYC 及相关蛋白的影响：KI-CDK9d-32 通过泛素 - 蛋白酶体途径有效降低 CDK9 水平，同时显著降低 MYC 蛋白和 mRNA 转录本水平。定量质谱分析显示，CDK9 和 MYC 的降解伴随着 MYC 调控网络中相关激酶（如 AURKA、PLK1、CDK11B 和 WEE1）水平的降低。此外，通过通路富集分析发现，KI-CDK9d-32 处理后，参与细胞周期调控、细胞应激和生长信号响应的蛋白质减少，核糖体生物发生相关蛋白增加，这表明细胞增殖和生长受到抑制，同时出现核仁应激状态。
3. 对核仁稳态的破坏：核糖体生物发生受 MYC 严格调控，抑制 MYC 网络可导致核糖体生物发生崩溃和蛋白质合成抑制。研究发现，KI-CDK9d-32 处理会破坏核糖体生物发生，通过高分辨率免疫荧光显微镜观察发现，它能在 2 小时内破坏核仁稳态，主要影响核仁的外层（由 NPM1 定义的核仁边缘），与经典的核仁应激模型不同，对核仁核心颗粒区影响较小。RT-qPCR 分析也证实了 KI-CDK9d-32 能显著降低前 rRNA 水平，表明其对核仁的破坏作用。
4. 对 MYC 转录的持续抑制：与 CDK9 抑制不同，CDK9 降解能快速且持续地下调 MYC 转录。qPCR 和 RNA 测序实验表明，KB-0742 抑制 CDK9 会导致 MYC mRNA 水平在 2 小时内呈剂量和时间依赖性增加，而 KI-CDK9d-32 处理则显著抑制 MYC 转录。此外，降解 CDK9 还会引发对早期生长信号和先天炎症相关通路的抑制，对不同细胞系的转录程序产生不同影响，在某些细胞系（如 MOLT-4 和 PSN-1）中，对增殖相关基因的转录抑制作用更为明显。
5. 细胞敏感性及相关生物标志物：KI-CDK9d-32 对多种癌细胞系具有显著的细胞毒性，其平均 IC₅₀值为 82.6 nM，低于 KB-0742（926 nM）。通过对约 800 种癌细胞系的敏感性分析发现，CRBN 的表达、蛋白水平和拷贝数改变是对 KI-CDK9d-32 敏感性的重要驱动因素，而 ABCB1 介导的外排活性则是主要的耐药驱动因素。在不同细胞系中，还发现了一些与敏感性相关的其他生物标志物，如核糖体蛋白 L15（RPL15）等。

研究结论

1. 治疗优势：靶向降解 CDK9 为癌症治疗提供了一种更有效的策略。与传统的 CDK9 抑制相比，CDK9 降解能更有效地抑制 MYC 转录，避免补偿性增加，从而更显著地影响 MYC 驱动的过程。这一发现为开发针对 MYC 驱动癌症的治疗方法提供了新的思路和潜在途径。
2. 临床应用前景：尽管部分具有高转运体活性的细胞系对 KI-CDK9d-32 的敏感性降低，但整体上其敏感性仍优于抑制疗法。后续研究需在体内进一步验证这些发现，并探索 KI-CDK9d-32 的新型递送和靶向策略，以充分发挥其治疗潜力。
3. 研究局限性：本研究存在一定局限性。仅比较了 KI-CDK9d-32 和 KB-0742 这一对具有共同母分子的化合物，观察到的差异可能部分源于动力学和效力的变化，而非内在机制的差异，需要更广泛地评估多个 CDK9 降解剂和抑制剂对来验证结论。此外，研究主要关注早期细胞反应（<12 小时），可能忽略了长期暴露后出现的蛋白质周转和适应性机制。同时，缺乏对三元复合物形成的详细结构见解，且研究主要基于体外生化测定和细胞系模型，未涉及体内药代动力学、疗效和毒性特征。未来研究应针对这些方面展开，以更全面地评估 CDK9 降解在癌症治疗中的作用。