新冠病毒 Nsp1 蛋白：mRNA 降解与翻译抑制机制新解，开启抗疫研究新征程

《Cell Reports》：The impact of Coronavirus Nsp1 on host mRNA degradation is independent of its role in translation inhibition

这篇研究聚焦新冠病毒非结构蛋白 1（Nsp1），通过无细胞翻译系统，揭示其介导宿主 mRNA 降解独立于翻译抑制，且不同冠状病毒 Nsp1 作用机制有差异。该成果为理解病毒感染机制、开发靶向疗法提供关键依据。

　　

研究背景

在 β 冠状病毒感染过程中，非结构蛋白 1（Nsp1）作为首个产生的病毒蛋白，在劫持宿主基因表达为病毒服务方面发挥着关键作用。SARS-CoV-2 的 Nsp1 蛋白序列分为 N 端结构域（NTD，残基 1 - 128）、20 个氨基酸长的连接区（128 - 148）和 C 端结构域（CTD，148 - 180）。其 CTD 可结合 40S 核糖体亚基的 mRNA 进入通道，抑制宿主 mRNA 翻译，促进病毒蛋白的产生，这一策略在 β 冠状病毒中较为常见，如 MERS-CoV 和 Bat-Hp-CoV。

除了抑制细胞翻译，Nsp1 还能诱导宿主 mRNA 降解。在人类细胞中过表达 Nsp1 足以使大多数宿主 mRNA 靶向降解，感染 SARS-CoV-2 的细胞中，成熟的胞质细胞 mRNA 会以 Nsp1 依赖的方式加速降解，而病毒 mRNA 则不受影响。有研究表明，Nsp1 与核糖体的结合是宿主 mRNA 降解的必要条件，Nsp1 的 NTD 对诱导 mRNA 降解至关重要，它主要在 5′非翻译区（5′ UTR）和近端编码区诱导 mRNA 切割。

由于 Nsp1 在阻碍宿主早期免疫反应方面的作用，且其与人类蛋白缺乏同源性，已成为理想的药物靶点。此前的研究提出了一些潜在的 Nsp1 抑制剂，如孟鲁司特（montelukast）和氨磷汀（ametantrone），但它们对 Nsp1 功能的影响尚不清楚。此外，探究翻译抑制和 mRNA 降解之间的关系，对于深入理解 Nsp1 的功能至关重要。

研究目的

本研究旨在利用无细胞翻译系统，探究 Nsp1 介导的 mRNA 降解是否依赖于主动翻译，以及降解是否是翻译抑制的次生效应，从而明确翻译抑制和 mRNA 降解这两种活动能否分离，为理解 Nsp1 的功能机制和开发针对冠状病毒感染的治疗策略提供依据。

实验设计

1. 实验材料：选用 HeLa S3 细胞和 HEK293 Flp-In T-REx 细胞进行实验，这些细胞系经过支原体检测为阴性，并通过基因分型进行了鉴定。实验中使用了多种试剂和抗体，如重组 SARS-CoV-2 Nsp1 蛋白、孟鲁司特钠水合物、氨磷汀、兔抗 RPL4 抗体、兔抗 EDF1 抗体等，具体信息在关键资源表中详细列出。
2. 实验方法
   • 细胞培养与转染：HEK293 Flip-In 细胞在添加了 10% 胎牛血清和 100 单位 /ml 青霉素 - 链霉素的 DMEM 培养基中，于 37°C、5% CO₂条件下培养，使用 Trypsin-EDTA PBS 进行细胞传代。转染实验中，将相应的质粒与 DNA Dogtor 转染试剂混合，在 Opti-MEM 培养基中孵育后加入细胞，过夜培养。
   • 多聚核糖体分析和蛋白质免疫印迹分析：转染或处理后的细胞经裂解、离心后，将细胞裂解物加载到 15% - 50% 的蔗糖梯度溶液中进行超速离心，收集蔗糖梯度中的各组分，进行蛋白质沉淀、洗涤、变性后，通过 SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白质，再转移到硝酸纤维素膜上，用相应的抗体进行免疫印迹分析，检测蛋白质的表达和定位。
   • 制备 HeLa 翻译活性裂解物：HeLa S3 细胞培养至一定密度后，经离心、洗涤，重悬于翻译活性缓冲液中，通过双离心法裂解细胞，再经离心去除细胞碎片，收集上清液（即裂解物），分装后冻存于 - 80°C。
   • 重组蛋白制备：所有重组表达的 SARS-CoV-2、MERS-CoV 和 Bat-Hp-CoV 的 Nsp1 蛋白以及对照蛋白 Ecoli-Trx-SARS-CoV-2-Nsp1-CTD KH-AA，均按照之前描述的方法进行制备，制备后的蛋白经透析、浓度测定后用于后续实验。
   • 体外翻译实验：将 HeLa S3 裂解物与鼠源 RNase 抑制剂混合，加入重组蛋白、mRNA 报告基因等进行体外翻译反应。反应结束后，通过荧光素酶检测监测蛋白质合成输出，通过 Northern blot 分析和 RT-qPCR 检测 mRNA 的稳定性。在评估潜在 Nsp1 抑制剂的实验中，将抑制剂与重组 SARS-CoV-2 Nsp1 WT 蛋白混合后加入翻译反应体系。
   • 克隆、表达和纯化荧光素酶报告质粒：以含有病毒前导序列的 MS2 标记的 mRNA 报告基因为基础，通过 PCR 扩增、定点突变、In-Fusion HD 克隆等方法构建突变体报告质粒，经测序验证后进行后续实验。
   • 体外转录报告荧光素酶 mRNA：用于体外转录的 DNA 质粒经线性化、纯化后，作为模板在含有多种转录相关酶和核苷酸的反应体系中进行转录，转录后添加 7 - 甲基鸟苷酸帽，再经纯化、定量后得到用于实验的 mRNA。
   • 逆转录和 qPCR：从体外翻译反应中提取 RNA，经逆转录合成 cDNA，再以 cDNA 为模板，使用特定的引物对进行 qPCR 反应，通过监测荧光信号，计算 mRNA 的相对表达水平。
   • Northern blot 分析：合成针对目标 RNA 的特异性探针，经标记、纯化后用于 Northern blot 实验。将体外翻译反应的 RNA 进行变性、电泳分离，转移到膜上，经交联、染色、预杂交后，与标记探针杂交，再经洗涤、曝光，使用 ImageJ 软件对杂交条带进行定量分析。

实验结果

1. Nsp1 促进 mRNA 降解独立于核糖体碰撞：在 HEK293T 细胞中表达 N 端 3×FLAG 标记的 SARS-CoV-2 野生型（WT）或不能结合核糖体的突变体 KH-AA Nsp1，通过多聚核糖体分析监测核糖体碰撞情况。结果显示，WT Nsp1 表达导致 80S 单核糖体峰增加，多聚核糖体信号减少，但无论是 WT 还是 KH-AA 突变体，EDF1 主要存在于游离组分和 40S 核糖体中，表明 Nsp1 依赖的宿主 mRNA 降解独立于一般的核糖体碰撞诱导的质量控制途径。
2. Nsp1 与核糖体的结合是宿主 mRNA 降解的必要条件：利用基于人类的体外翻译系统，对带有非病毒 5′ UTR 的荧光素酶（RLuc）报告基因 mRNA 进行体外翻译实验。结果表明，WT Nsp1 抑制翻译并促进 mRNA 降解，而核糖体结合突变体 KH-AA 不能抑制翻译，也无法促进 mRNA 降解；RK-AA 突变体虽能部分抑制翻译，但不引起 mRNA 降解。此外，在翻译延伸抑制剂嘌呤霉素存在的情况下，WT Nsp1 仍能诱导 mRNA 降解，说明延伸不是 Nsp1 介导的 mRNA 降解的先决条件。
3. Nsp1 介导非病毒 mRNA 5′端附近的降解：进行体外翻译时间进程实验，用 5′和 3′特异性探针检测报告基因 mRNA 的稳定性。结果显示，WT Nsp1 导致报告基因 mRNA 在 5′端出现明显的时间依赖性降解，而 3′端信号相对稳定，表明 Nsp1 诱导的切割发生在转录本的 5′端附近。
4. 即使翻译完全停止，Nsp1 仍促进 mRNA 降解：使用核糖体扫描抑制剂 rocaglamide 进行体外翻译实验，结果表明 WT Nsp1 在 rocaglamide 存在的情况下仍能导致报告基因 mRNA 降解，说明 Nsp1 可以在不进行扫描的情况下刺激降解。使用无帽 mRNA 进行实验进一步证实，Nsp1 介导的降解不依赖于经典的起始和翻译延伸。
5. MERS-CoV Nsp1 可独立于 mRNA 降解抑制 mRNA 翻译：对 MERS-CoV WT Nsp1 或不能结合 40S 的突变体 KY-AA 进行体外翻译实验，结果显示 WT MERS-CoV Nsp1 能强烈抑制翻译，但不会影响报告基因 mRNA 的稳定性，表明 MERS-CoV Nsp1 与 SARS-CoV-2 Nsp1 在作用机制上存在差异。
6. 潜在 Nsp1 抑制剂的评估：用氨磷汀和孟鲁司特处理含有 Nsp1 的裂解物，通过荧光素酶检测发现，这两种化合物在测试的浓度下均不影响 Nsp1 抑制宿主细胞翻译的能力，说明寻找潜在的 Nsp1 抑制剂仍需进一步研究。
7. Nsp1 对翻译抑制的物种特异性保护：构建含有不同 5′ UTR 的 RLuc 报告基因 mRNA，进行体外翻译实验。结果显示，SARS-CoV-2 Nsp1 能促进含有自身 WT 5′ UTR 的报告基因 mRNA 的翻译，而突变的 5′ UTR 则失去这种保护作用。不同冠状病毒的 Nsp1 主要保护含有相应 5′ UTR 的报告基因 mRNA，表明 Nsp1 可能与其基因组 5′ UTR 共同进化，以提供对病毒翻译的保护。

研究结论

本研究利用无细胞翻译系统，成功分离了 Nsp1 介导的翻译抑制和 mRNA 降解这两种活动。研究发现，SARS-CoV-2 Nsp1 依赖的 mRNA 降解不依赖于主动翻译，Nsp1 与核糖体的结合是刺激宿主 mRNA 降解的充分条件。MERS-CoV Nsp1 与 SARS-CoV-2 Nsp1 在介导宿主细胞基因表达抑制的机制上存在差异，前者抑制翻译但不导致 mRNA 降解。此外，之前提出的 Nsp1 抑制剂氨磷汀和孟鲁司特对 Nsp1 抑制翻译的能力没有影响。研究还观察到不同冠状病毒的 Nsp1 与 5′ UTR 之间可能存在共同进化，使得病毒 mRNA 能够逃避 Nsp1 的抑制作用。

然而，本研究也存在一定的局限性。研究主要依赖于无细胞翻译系统，可能无法完全重现细胞内环境的复杂性，例如 Nsp1 与宿主因子的相互作用以及细胞区室化的影响。虽然观察到 SARS-CoV-2 Nsp1 诱导的 mRNA 降解独立于核糖体碰撞，但不能排除在 Nsp1 存在的情况下，核糖体碰撞可能在低程度上发生并对宿主 mRNA 降解有微小贡献。此外，关于病毒 mRNA 受 Nsp1 保护的功能意义，在共感染场景或更广泛的冠状病毒范围内尚未进行测试。未来的研究可以进一步探究 Nsp1 与宿主细胞因子的相互作用机制，以及在体内环境中 Nsp1 的功能，为开发针对冠状病毒感染的有效治疗策略提供更坚实的理论基础。