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这篇研究发现，肝脏胆红素代谢途径可促进机体抗病毒先天免疫。病毒感染会上调肝脏中尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶 1A1（UGT1A1）表达，其稳定 IRF3 蛋白促进 I 型干扰素（IFN-I）产生；而胆红素则抑制 IFN-I 信号。该研究揭示了胆红素代谢在抗病毒免疫中的重要意义。
胆红素代谢与抗病毒免疫研究背景
人体的正常运转在很大程度上依赖肝脏代谢，其中胆红素代谢是关键环节之一。胆红素是红细胞中血红蛋白降解产生的色素，血清中的未结合胆红素（UCB）进入肝脏，在尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶 1A1（UGT1A1）的催化下代谢为结合胆红素（CB），随后随胆汁排入肠道，这是人体唯一的胆红素解毒代谢途径 。目前，关于胆红素代谢途径的研究主要集中在 UGT1A1 作为葡萄糖醛酸基转移酶的功能上，其启动子区域的基因多态性与高胆红素血症密切相关，但该途径在其他病理生理过程中的意义尚不清楚。
肝脏不仅是代谢器官，也是重要的免疫组织，在抵御微生物感染中发挥关键作用。先天免疫作为宿主防御的第一道防线，其中 I 型干扰素（IFN-I，包括 IFN-α/β）是抗病毒先天免疫的关键组成部分，由多种内源性和外源性刺激诱导产生。在病毒感染时，细胞内的环状 GMP-AMP 合酶（cGAS）识别病毒 DNA，维甲酸诱导基因 I（RIG-I）样受体（RLRs）识别病毒 RNA，随后招募衔接蛋白，激活下游的 TANK 结合激酶 1（TBK1），进而使转录因子 IFN 调节因子 3（IRF3）磷酸化，启动 IFN-I 的转录表达 。IFN-I 产生后，与 IFN-I 受体（IFNAR1 和 IFNAR2）结合，激活 Janus 激酶（JAK）- 信号转导与转录激活因子（STAT）通路，诱导干扰素刺激基因（ISG）的表达，发挥抗病毒作用。然而，机体如何精细调控 IFN-I 产生及 JAK-STAT 通路以维持体内平衡，仍有待深入探索。
UGT1A1 在病毒感染时肝脏中的特异性上调
肝脏具有独特的血液供应系统，在病毒感染时往往首当其冲并率先启动免疫反应。研究人员分析了丙型肝炎病毒（HCV）感染的 Huh7.5.1 细胞和乙型肝炎病毒（HBV）感染的人原代肝细胞的 RNA 测序数据，发现肝和肠道脂质代谢相关酶中，只有 UGT1A1 在 HBV 和 HCV 感染时均显著上调。
为进一步验证，研究人员用水泡性口炎病毒（VSV）感染小鼠，观察到病毒感染后肝脏细胞中 UGT1A1 特异性上调，而肾脏、心脏、脾脏和肺细胞中 UGT1A1 水平无明显变化。用多种病毒（VSV、仙台病毒 SeV、甲型流感病毒 H1N1 等）感染肝癌细胞系 HepG2 后，发现病毒感染组 UGT1A1 的 mRNA 和蛋白水平均显著高于未感染组。核因子 κB（NF-κB）抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）可阻断病毒诱导的 UGT1A1 上调，且 UGT1A1 主要在小鼠肝细胞中表达和被病毒上调，在非实质细胞（NPCs）中则无此现象。这些结果表明，UGT1A1 在肝脏中对病毒感染有特异性上调反应。
UGT1A1 促进 IFN-I 产生并发挥广谱抗病毒作用
研究人员探究 UGT1A1 在抗病毒先天免疫中的作用，结果显示，敲低 UGT1A1 会促进多种病毒（如 RNA 病毒 VSV、SeV、H1N1 和 DNA 病毒 HSV-1、HBV）的感染，而过表达 UGT1A1 则显著抑制病毒感染，降低病毒 RNA 水平和病毒编码蛋白水平，这表明 UGT1A1 具有广谱抗病毒活性。
进一步研究发现，敲低 UGT1A1 会下调病毒感染诱导的 IFNβ mRNA 水平，而过表达 UGT1A1 或使用 UGT1A1 基因敲除（KO）的 HepG2 细胞系研究表明，UGT1A1 能正向调节 IFN-I 的产生和 IFN-I 信号通路，促进 ISG 的表达。构建失去葡萄糖醛酸基转移酶活性的 UGT1A1 突变体 G308E 进行实验，发现野生型（WT）UGT1A1 和 UGT1A1-G308E 在促进 IFNβ 表达和病毒诱导的 IFNβ 产生方面能力相当，说明 UGT1A1 介导的 IFN-I 上调不依赖其酶活性。
UGT1A1 通过泛素 E3 连接酶 c-Cbl 稳定细胞 IRF3 蛋白
为探究 UGT1A1 正向调节 IFN-I 产生的分子机制，研究人员检测 UGT1A1 对 RLR 信号通路中关键分子诱导的 IFN-I 产生的影响。敲低 UGT1A1 显著抑制 RIG-I、MAVS、TBK1 和组成型激活的 IRF3 变体 IRF3-5D 诱导的 IFNβ 产生 ，表明 UGT1A1 可能作用于 IRF3 或其结合伙伴。进一步研究发现，UGT1A1 不影响 TBK1 与 IRF3 的相互作用，且能在 Tbk1-/-小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中促进 IFNβ 产生，说明 UGT1A1 促进 IFN-I 产生不依赖 TBK1。通过检测相互作用发现，UGT1A1 与 IRF3 相互作用，而与 RIG-I、MAVS、TBK1 无相互作用。
敲低 UGT1A1 会降低 IRF3 蛋白水平，过表达则上调 IRF3 蛋白水平，且 UGT1A1 敲低不影响 IRF3 的 mRNA 水平，说明 UGT1A1 在蛋白水平影响 IRF3。研究发现，UGT1A1 敲除会增加 IRF3 的泛素化水平，伴随 IRF3 蛋白水平下降，而过表达 UGT1A1 则剂量依赖性地降低 IRF3 的泛素化水平。研究人员检测已知的 IRF3 的 E3 泛素连接酶，发现敲除 c-Cbl 可消除 UGT1A1 介导的 IFN-I 产生上调，在 c-Cbl-/-肝细胞中，UGT1A1 不再促进病毒刺激的 IFNβ 产生。此外，过表达 UGT1A1 会剂量依赖性地减弱 c-Cbl 与 IRF3 的相互作用，降低 K48 连接的 IRF3 泛素化水平。综上，UGT1A1 通过抑制 c-Cbl 介导的 IRF3 泛素化，稳定细胞 IRF3 水平。
胆红素减弱 IFN-I 诱导的信号强度并降低抗病毒效果
UGT1A1 催化 UCB 与葡萄糖醛酸结合生成 CB。研究胆红素对病毒感染和 IFNβ 产生的影响时发现，UCB 和 CB 均促进病毒感染，但不影响病毒诱导的 IFNβ 产生。进一步研究发现，UCB 和 CB 显著抑制 IFN-I 诱导的 ISG 表达，且 UCB 的抑制作用更强。
在生理状态下，人体总胆红素浓度为 4.0 - 17.1 μM，UCB 浓度为 0 - 16 μM ，但许多肝脏或胆道系统疾病会导致胆红素水平异常升高。用不同浓度 UCB 处理细胞发现，UCB 剂量依赖性地下调 IFN-I 诱导的 ISG 表达。用 20 μM UCB（略高于正常浓度上限）处理多种细胞，包括 THP1、HepG2、Raw264.7 细胞和骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs），发现 UCB 显著降低 IFN-I 诱导的 ISG mRNA 和蛋白水平，且呈时间依赖性。
在探究 UCB 对 IFN-I 介导的抗病毒作用的影响时，用小鼠 IFNβ（mIFNβ）预处理 Raw264.7 细胞，同时添加或不添加 UCB，再感染不同病毒，发现 UCB 剂量依赖性地抑制 IFN-I 介导的抗病毒作用。通过免疫荧光检测和病毒编码蛋白检测也证实，UCB 降低了 IFN-I 的抗病毒活性。这些结果表明，胆红素下调 IFN-I 诱导的免疫信号和抗病毒活性。
胆红素通过结合 IFN-I 抑制 JAK-STAT 信号通路
研究人员探究 UCB 抑制 IFN-I 信号通路的靶点，发现 UCB 和 CB 均显著下调 IFN 诱导的 p-STAT1 水平，且 UCB 抑制作用更强，20 μM UCB 可显著抑制多种细胞中 IFN-I 诱导的 STAT1 磷酸化，且该浓度 UCB 不显著导致细胞死亡。UCB 还抑制 IFN-I 诱导的 JAK1 和 TYK2 激活。
由于 UCB 能结合 Protein G 琼脂糖珠，研究人员用结合 UCB 的 Protein G 琼脂糖珠与 FLAG-IFNα、FLAG-IFNAR1 或 HA-IFNAR2 蛋白孵育，发现 FLAG-IFNα 能与 UCB-Protein G 琼脂糖珠结合，而 FLAG-IFNAR2 和 HA-IFNAR2 不能，表明 IFN-I 可与 UCB 相互作用。通过分子对接模拟发现，UCB 与 IFNα 的多个氨基酸相互作用，结合能为 -6.71 kcal/mol，结合稳定，且结合位点与 IFNAR2 结合 IFNα 的位点重合，提示 UCB 与 IFNα 的结合可能阻止 IFNα 与 IFNAR2 的相互作用。
体内和体外结合实验证实，UCB 剂量依赖性地阻断 IFNα 与 IFNAR2 的相互作用，体外结合实验还表明 UCB 竞争性抑制 IFNα 与 IFNAR2 的结合。测定 IFNα 与 UCB、IFNAR2 和 IFNAR1 的结合亲和力发现，高浓度的 UCB 在血清中可竞争性限制 IFN-I 与其受体的结合。综上，UCB 通过与 IFN-I 结合，限制 IFN-I 诱导的 JAK-STAT 信号通路。
UGT1A1 和 UCB 在体内调节 IFN-I 免疫信号
UGT1A1 在体内物质代谢和解毒中起重要作用，UGT1A1 基因缺陷会导致小鼠死亡，因此研究人员采用小干扰 RNA（siRNA）策略降低肝脏中 UGT1A1 水平。给小鼠尾静脉注射针对 UGT1A1 的 siRNA（siUGT1A1），72 小时后感染 VSV，结果显示，小鼠肝脏中 Ugt1a1 mRNA 水平显著下调，血清 UCB 水平显著升高，肝脏中 IFNβ mRNA 和蛋白水平降低，病毒感染加重，肝脏炎症加剧，ISG 表达显著减弱，表明肝脏 UGT1A1 在体内促进 IFN-I 产生，发挥抗病毒功能。
给小鼠腹腔注射 UCB（25 mg/kg 体重）1 小时后，再腹腔注射 mIFNβ（10,000 IU / 只）6 小时，检测发现肝脏、肾脏和心脏组织中 ISG 表达均显著下调，说明 UCB 在体内抑制 IFN-I 信号。收集 11 例慢性乙型肝炎（CHB）患者 IFN-I 治疗前后的血清和外周血单核细胞（PBMCs），发现胆红素浓度高的患者对 IFN-I 治疗反应差，IFN-I 难以诱导 PBMCs 中 ISG 的表达，表明高浓度 UCB 在体内减弱 IFN-I 信号。
研究讨论
已有研究揭示了一些代谢途径在调节免疫中的作用，如胆固醇代谢途径中的 7 - 脱氢胆固醇（7-DHC）抑制 IFN-I 产生 。UGT1A1 作为 II 相代谢酶家族的重要成员，其基因多态性和酶活性在药物代谢中的作用已被广泛研究，但在先天免疫中的功能尚未见报道。本研究发现，病毒感染时肝脏中 UGT1A1 时间依赖性上调，且 UGT1A1 促进 IFNβ 产生不依赖其葡萄糖醛酸基转移酶活性，而是通过阻断 c-Cbl 介导的 IRF3 泛素化实现，揭示了 UGT1A1 的新功能。
胆红素作为 UGT1A1 的内源性代谢底物，以往研究表明其既具有神经毒性，又具有抗氧化作用。本研究发现，胆红素能与 IFN-I 结合，限制 IFN-I 与 IFNAR2 的结合，从而抑制 IFN-I 下游信号通路激活。虽然 IFNα 与胆红素的亲和力低于与 IFNAR2 的亲和力，但体内胆红素水平远高于细胞膜上 IFN-I 受体水平，高浓度胆红素可竞争性抑制 IFN-I 与受体结合及抗病毒信号传导。
综合研究结果，UGT1A1 和胆红素代谢与机体抗病毒免疫密切相关。正常胆红素代谢时，病毒感染上调肝脏 UGT1A1 表达，促进 IFN-I 产生和分泌，同时高效的胆红素代谢降低血清 UCB 水平，减弱 UCB 对 IFN-I 诱导的 JAK-STAT 抗病毒信号的抑制。而当 UGT1A1 表达因药物或疾病下调时，血清胆红素浓度升高，一方面减少 IFN-I 产生，另一方面高浓度胆红素结合 IFN-I，使其无法激活下游信号，抑制机体抗病毒免疫。
研究局限性
本研究虽发现病毒感染特异性上调肝脏 UGT1A1 表达，但未探究其 mRNA 水平受病毒感染刺激的具体机制。UCB 对 IFN-I 信号抑制作用强于 CB 的原因也不明确，未来可从结构差异和与 IFN-I 的相互作用方面深入研究。此外，IFN-I 治疗 CHB 存在疗效有限的问题，临床上胆红素显著升高（超过 5 倍）的 CHB 患者不适合 IFN-I 治疗，但胆红素轻度或中度升高的患者是否适合仍不清楚。本研究虽在 CHB 患者 PBMCs 中验证了胆红素升高抑制 IFN-I 介导的抗病毒作用，但样本量有限，未评估性别等因素的影响，未来需招募更多 CHB 患者明确胆红素浓度与 IFN-I 治疗疗效的关系。
