基因语法如何调控质粒基因表达与电路行为：解锁合成生物学新密码

《Journal of Biological Engineering》：Gene syntaxes modulate gene expression and circuit behavior on plasmids

在合成生物学中，实现质粒基因稳定且可预测的表达颇具挑战。为探究基因语法（gene syntaxes）对基因表达的影响，达特茅斯学院研究人员以双荧光蛋白系统展开研究。结果发现基因语法显著影响表达水平、比率及细胞间变异等，该成果为质粒和遗传电路合理设计提供关键见解。

　　

在合成生物学的广阔领域中，质粒作为一种重要的工具，被广泛应用于基因组编辑、重组蛋白生产、代谢工程以及遗传电路构建等多个方面。自 20 世纪 50 年代被发现以来，质粒一直发挥着不可或缺的作用。然而，即便拥有相同的启动子和质粒骨架，基因表达情况却常常大相径庭，这使得实现稳定且可预测的基因表达成为了合成生物学领域的一大难题。

在传统的质粒设计中，人们往往更关注启动子、核糖体结合位点（RBS）等基因内元件，却忽视了基因在质粒中的空间排列方式，也就是基因语法（gene syntaxes）对基因表达的影响。基因语法涵盖了基因的相对方向、位置和顺序等方面，这些因素能够显著影响基因表达动态。例如，在转录过程中，DNA 超螺旋会影响 RNA 聚合酶（RNAPs）的结合，进而改变邻近基因的转录情况；转录与复制机器之间的碰撞也会对基因表达产生重要影响。

同时，细胞间变异（gene noise，基因噪声）在生物系统中普遍存在，它会导致表型和功能的异质性，降低工程生物系统的可靠性和可预测性，这在合成生物学的应用中是一个亟待解决的问题。

为了深入探究基因语法对基因表达的影响，达特茅斯学院（Thayer School of Engineering, Dartmouth College）的研究人员开展了一项系统研究。他们利用双荧光蛋白系统，精心设计了多个具有不同基因语法的质粒构建体，对不同基因方向和顺序下的基因表达情况进行了全面分析，包括平均表达水平、相对表达比率以及细胞间变异等方面。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：一是利用特定的大肠杆菌（E. coli）菌株，如 NEB 10-beta 菌株构建质粒并测试其行为；二是运用 Flow cytometry（流式细胞术）对 GFP 和 RFP 信号进行量化分析；三是借助相关软件，如 RStudio 和 GraphPad Prism 进行数据分析和统计检验。

研究结果如下：

1. 不同基因语法导致不同的基因表达谱：研究设计了七种质粒构建体，包含不同基因语法的两个报告基因。结果显示，由于基因语法的不同，GFP 表达水平变化超过 1.8 倍，RFP 表达水平变化达 1.56 倍，且同一细胞内两个报告蛋白的表达比率也有显著差异，范围从 1.06 到 1.46。这表明基因语法能显著改变质粒中的基因表达。

2. 基因相对于质粒复制起点（Ori）的方向影响表达谱：通过对比 GFP 基因与质粒 Ori 同向（codirectional）和反向（head-on）的表达情况，发现同向基因表达水平更高。在不同质粒骨架中进行验证，结果依然如此。此外，基因方向还会影响细胞间变异，但在不同质粒中表现有所差异。在双报告基因的质粒构建体中，同向基因通常表达更多蛋白质，不过 RFP 在同向和反向表达差异的显著性受多种因素影响。

3. 两个相邻基因的相对方向影响表达水平：构建了具有不同相邻基因相对方向（收敛、发散和串联）的质粒。结果表明，串联方向的 GFP 和 RFP 表达水平最高，发散方向最低，而相对方向不影响 GFP/RFP 比率。DNA 超螺旋可能是导致发散方向基因表达受抑制的主要原因，但也可能存在其他影响因素。

4. 基因顺序影响质粒上的基因表达：比较了三对不同基因顺序的质粒构建体，发现改变 GFP 基因在质粒上的顺序会改变其表达，部分情况下 RFP 的表达也会因顺序改变而变化，同时基因顺序改变还可能影响 GFP/RFP 比率。

5. 基因语法对基因表达变异性的影响：研究发现不同蛋白质在相同质粒上即使由相同启动子和 RBS 序列驱动，也会表现出不同的表达变异性，RFP 的变异性始终高于 GFP。虽然不同基因语法下总噪声水平变化不大，但内在噪声和外在噪声在不同基因排列下存在显著差异。

6. 基因语法对非相干前馈环（iFFL）行为的影响：设计了一个 iFFL 电路，研究发现基因相对于质粒 Ori 的方向能显著改变 iFFL 电路的行为，影响转录因子 AraC-RFP 的表达，进而导致下游 GFP 表达动态、稳态水平和细胞间变异性的差异。

研究结论表明，不同的基因方向和顺序会对基因表达的平均水平、相对表达比率以及细胞间变异产生显著影响。基因与质粒 Ori 同向时通常表达水平更高，相邻基因的相对方向和基因顺序也会对基因表达产生重要作用。基因语法还会影响基因噪声，尽管不同语法下总细胞间变异不变，但内在和外在噪声有所不同。此外，基因语法能够影响遗传电路的行为，如 iFFL。

这项研究的重要意义在于，它强调了基因语法在质粒设计中的关键作用，为合理设计质粒和遗传电路提供了重要的理论依据，有助于提高合成生物学系统的可靠性和精确性，推动合成生物学领域的进一步发展。