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透明质酸（HA）在多领域应用广泛，传统生产方式存在局限。研究人员开展蓝藻代谢工程研究，利用模块化基因表达和 CRISPRi 系统优化代谢途径。结果显示，工程菌株 SeHA226 可高效合成 HA，为大规模光合生产 HA 提供方向。
在生物医学和化妆品领域，透明质酸（Hyaluronic acid，HA）就像一颗璀璨的 “明星分子”。它是一种由 N - 乙酰葡糖胺（GlcNAc）和葡糖醛酸（GlcA）重复单元组成的线性无分支生物聚合物，凭借独特的保湿、润滑等特性，在药物递送、医美填充、护肤品等方面都占据着重要地位。
早期，HA 主要从动物组织中提取，比如鸡冠、牛眼等，但这种方法产量低、成本高，还存在病原体污染风险。后来，微生物发酵法崭露头角，利用像兽疫链球菌（Streptococcus zooepidemicus）这类天然生产者，或是对大肠杆菌（Escherichia coli）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）等进行代谢工程改造来生产 HA。然而，这些生产过程往往依赖糖类等有机碳源，不仅成本不低，还面临着可持续性挑战。与此同时，全球都在积极应对气候变化，将目光投向了利用微生物把二氧化碳（CO2）转化为高附加值产品的方向。在这样的背景下，研究如何让蓝藻（Cyanobacteria）利用 CO2高效合成 HA，就成了科研人员们努力攻克的难题。
韩国成均馆大学（Sungkyunkwan University）的研究人员勇挑重担，开展了相关研究。他们以聚球藻（Synechococcus elongatus）PCC 7942 为研究对象，借助模块化基因表达系统和 CRISPR 干扰（CRISPR interference，CRISPRi）系统，对蓝藻的代谢途径进行优化。研究成果发表在《Journal of Biological Engineering》上，为光合驱动的生物聚合物生产开辟了新道路。
研究人员在这项研究中运用了多种关键技术方法。首先是基因工程技术，将来源于不同物种的相关基因，如来自兽疫链球菌的 hasA、化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的 hasB 和 hasC ，以及大肠杆菌的 glmU、glmM 和 glmS 进行密码子优化后，构建到质粒载体中，并整合到蓝藻基因组的中性位点。其次是 CRISPRi 技术，设计针对特定基因的 crRNA，与 dCas12a 结合形成复合物，抑制目标基因表达，调控代谢通量。此外，还使用了定量检测和分子重量分析技术，通过 HA 分析试剂盒检测 HA 产量，利用凝胶过滤色谱 - 折射率检测器（GPC - RI）测定 HA 分子重量。
设计模块化途径实现 HA 光合生产
聚球藻 PCC 7942 自身缺乏催化 HA 合成的透明质酸合酶（hyaluronan synthase，HAS），无法合成 HA。研究人员将 HA 生物合成途径模块化，分为 HA - GlcA 模块和 GlcNAc 模块。通过在蓝藻基因组中性位点 I（NSI）整合编码关键酶的基因，构建了表达不同模块组合的工程菌株，如 SeHA100、SeHA200、SeHA210 和 SeHA220。实验结果显示，只表达 HasA 的 SeHA100 无法检测到 HA 生产；引入 HA - GlcA 模块的 SeHA200 能产生少量 HA；而整合 GlcNAc 模块，尤其是共表达 glmS 基因的 SeHA220，HA 产量显著提升，达到 2.2 ± 0.85 mg/L，相比 SeHA200 增长了 27.5 倍 ，这表明优化 UDP - GlcNAc1P 和 UDP - GlcA 底物池对提高 HA 产量至关重要。
利用 CRISPR - dCas12a 提升光合 HA 产量
为进一步提高 HA 产量，研究人员借助 CRISPR - dCas12a 系统，靶向 F6P 和 G6P 代谢节点，抑制 zwf 和 pfk 基因表达，减少碳流向其他代谢途径，增加 HA 合成前体。实验以 SeHA210 和 SeHA220 为宿主菌株，构建了一系列基因抑制菌株。结果发现，抑制 zwf 或 pfk 基因的菌株，如 SeHA214、SeHA215、SeHA224 和 SeHA225，HA 产量均有显著提高。其中，双抑制 zwf 和 pfk 基因的 SeHA226 表现最为突出，在 15 天时 HA 产量达到 5.0 ± 0.3 mg/L ，比 SeHA220 有明显提升。
工程蓝藻光合 HA 的分子量分析
研究人员对产量最高的 SeHA226 菌株所产光合 HA 进行分子量分析。通过凝胶过滤色谱技术，测定其重均分子量（Mw）为 4.2 MDa，数均分子量（Mn）为 0.8 MDa 。与其他工程菌株相比，该菌株合成的 HA 分子量与天然生产者相当，这说明前体平衡和生长条件对 HA 分子量影响重大。
研究结论表明，利用异源模块化基因表达系统和 CRISPRi 基因抑制系统对蓝藻进行代谢工程改造，能够实现从 CO2高效合成 HA。菌株 SeHA226 在 15 天内从 CO2直接合成了 5.0 ± 0.3 mg/L 的 HA，且分子量达到 4.2 MDa。优化异源代谢途径是实现高分子量光合 HA 生产的关键。这项研究为大规模光合生产 HA 提供了理论和技术基础，尽管目前在扩大生产规模方面还面临一些挑战，如 CO2供应成本、宿主对烟道气中有毒物质的耐受性等，但研究成果仍为未来可持续生物制造 HA 指明了方向，有望推动相关产业的绿色发展。
