水稻条纹花叶病毒磷蛋白形成病毒工厂样颗粒，为病毒复制的关键密码

《Phytopathology Research》：Rice stripe mosaic virus encoded phosphoprotein forms viral factory-like granules and is crucial for viral replication

水稻条纹花叶病毒（RSMV）危害水稻生产，但其复制和装配机制不明。研究人员构建 RSMV 微型复制子（MR）系统，发现 RSMV 磷蛋白（P）形成病毒工厂样颗粒，IDR2 区域对颗粒形成和 MR 复制至关重要。该研究为深入探究病毒机制奠定基础。

　　在植物病毒的神秘世界里，病毒如同隐藏在暗处的 “破坏者”，威胁着农作物的健康生长。水稻条纹花叶病毒（RSMV）便是其中之一，它作为一种植物弹状病毒，给水稻生产带来了严重的损失。然而，一直以来，科学家们对 RSMV 的复制和装配机制了解甚少，就像在黑暗中摸索，找不到照亮前路的明灯。这种未知使得防控工作困难重重，如同没有地图的探险，充满了不确定性。

为了揭开 RSMV 的神秘面纱，华南农业大学的研究人员勇敢地踏上了探索之旅。他们构建了 RSMV 微型复制子（MR）系统，以本氏烟草（Nicotiana benthamiana）为研究对象，深入研究 RSMV 磷蛋白（P）在病毒复制过程中的作用。最终，他们取得了重要突破。研究发现，RSMV P 能形成病毒工厂（VF）样颗粒，是病毒工厂的重要组成部分，而且 P 蛋白颗粒的形成对病毒复制至关重要，其中 IDR2 区域是 P 蛋白形成颗粒的关键区域，对 MR 复制不可或缺 。这一发现为理解 RSMV 的致病机制提供了关键线索，也为后续防控策略的制定指明了方向，就像在黑暗中找到了一丝曙光。该研究成果发表在《Phytopathology Research》上。

在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：通过农杆菌介导的转化法将重组质粒导入本氏烟草；利用荧光观察技术，借助共聚焦激光扫描显微镜观察荧光信号，从而分析蛋白的亚细胞定位；运用实时定量逆转录聚合酶链式反应（qRT-PCR）检测 MR 的复制水平；采用 Western 印迹分析来检测相关蛋白的表达水平 。

研究结果如下：

• 构建 RSMV 反基因组和基因组 RNA 微型复制子系统：研究人员基于 RSMV 反基因组 RNA 构建了 RSMV 反基因组微型复制子（agMR），将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和红色荧光蛋白（mRFP）分别替代病毒的 N 和 P 基因；同时构建了基因组微型复制子（gMR），其序列与 agMR 相同但方向相反。将含有 agMR/gMR、RSMV 的 N、P、L 蛋白表达质粒以及病毒 RNA 沉默抑制子（VSRs）的农杆菌混合后浸润本氏烟草叶片，结果显示，agMR 和 gMR 系统均能成功表达 GFP，且 agMR 系统的复制效率更高，这表明研究人员成功建立了 RSMV agMR 和 gMR 系统。
• N、P、L 和 VSRs 对 agMR/gMR 报告基因表达的影响：为探究各蛋白对报告基因表达的作用，研究人员分别在缺失 N、P、L、agMR/gMR 或 VSRs 的情况下进行实验。结果发现，虽然 GFP 在部分组合中仍能表达，但完整组合的 agMR/gMR 系统中 GFP 荧光强度显著更高，且 mRFP 仅在完整组合中表达。这说明所有组件对于 agMR/gMR 报告基因在体内的表达都是必不可少的。
• RSMV GFP-P 形成 VF 样颗粒并对 agMR 复制起作用：研究人员对 RSMV 核心蛋白 N 和 P 进行亚细胞定位研究，发现 GFP-P 在细胞质中形成颗粒，类似病毒工厂样颗粒，而 P-GFP 也大多定位于细胞质并形成较小的类似颗粒。在水稻中进行的免疫吸附电子显微镜观察显示，P 蛋白在病毒工厂中大量存在。进一步研究发现，GFP-P 或野生型 P 支持下的 agMR RNA 积累相似，而 P-GFP 支持下的积累较低，且 GFP-P 或野生型 P 支持下的 RFP 荧光强度相似，P-GFP 支持下的强度较弱，这表明 RSMV P 参与了病毒工厂的形成且对 agMR 复制至关重要。此外，研究人员还发现 P3 蛋白也能在体内形成颗粒，但对 agMR 表达无明显影响。
• P 的 IDR2 区域负责 P 颗粒的形成且对 agMR 复制很重要：通过对 RSMV P 蛋白进行内在无序区域（IDR）预测，发现其含有三个潜在的 IDR 区域。研究人员构建了三个突变体 P^mIDR1、P^mIDR2和 P^mIDR3，结果显示，GFP-P^mIDR1和 GFP-P^mIDR3能形成颗粒，而 GFP-P^mIDR2无法形成颗粒。RT-qPCR、Western blot 和共聚焦荧光观察结果表明，P^mIDR2支持下的 agMR RNA 积累、GFP 和 RFP 蛋白水平以及报告基因表达均低于全长 P，这说明 IDR2 区域对 RSMV P 颗粒形成和 agMR 复制至关重要。

研究结论和讨论部分指出，本研究成功构建了 RSMV 微型复制子系统，为进一步研究病毒蛋白功能、致病机制以及构建全长感染性克隆奠定了坚实基础。同时，研究揭示了 RSMV P 蛋白形成颗粒的特性以及 IDR2 区域在病毒复制中的关键作用，为理解 RSMV 的感染机制提供了重要依据。此外，研究还发现 RSMV 的 P3 蛋白在体内形成颗粒，暗示其可能在病毒感染中发挥重要作用，但具体功能仍需进一步验证。这一系列研究成果为植物病毒领域的研究开辟了新的道路，有望为水稻条纹花叶病毒的防控提供新的策略和方法，对保障水稻生产安全具有重要意义。