中国国家突变小鼠资源中心的小鼠资源进展

小鼠模型在生物医学研究及药物开发临床前研究中占据重要地位。中国国家突变小鼠资源中心（NRCMM）自 2001 年启动，2019 年成为国家科技资源共享平台的一员，目前由南京大学模式动物研究所和药明康德（Gempharmatech，GPT）共同管理。2024 年，该中心保有超 22,000 种小鼠品系，相比 2022 年的 18,500 种有显著增长。本综述主要围绕 NRCMM 的敲除全项目（Knock-Out All Project，KOAP）、免疫系统重建模型、疾病模型以及染色体替代系展开介绍。

KOAP 项目进展

项目概况、设计策略与质量控制

KOAP 项目于 2018 年启动，旨在利用 CRISPR/Cas 基因编辑技术构建常规敲除（KO）和条件性敲除（floxed，cKO）小鼠品系。截至 2024 年 6 月，已成功构建 10,881 个基因的 KO 品系和 9,874 个基因的 cKO 品系，完成约 50% 的项目计划。用户可在www.gempharmatech.com网站，通过输入基因名搜索所需 KOAP 品系，网站还提供详细的策略设计、基因分型方案和材料转移协议（Material Transfer Agreement，MTA）等信息。

在设计新的 KO 和 cKO 品系时，除遵循以往原则，如选择 flox 或缺失区域、loxP 之间的距离、loxP 插入内含子的位置等，还依据对基因组理解的深入和合作反馈，遵循额外设计规则。例如，尽量减少敲除等位基因的 mRNA 产物逃避无义介导的衰变（nonsense-mediated decay，NMD），使提前终止密码子（premature stop codons，PTCs）的定位符合 “NMD 规则”，远离起始 / 终止密码子、最后一个外显子或长外显子，以最大化降解异常 mRNA。同时，为降低对邻近基因表达的影响，会仔细评估并尽量避免删除注释的调控序列，包括但不限于启动子、增强子和 CCCTC 结合因子（CCCTC-binding factor，CTCF）结合位点。

对于 KO 和 cKO 等位基因的基本质量控制（QC），通过 PCR 和 Sanger 测序，使用位于 KO 等位基因缺失区域或 cKO 等位基因 loxP 插入位点两侧的等位基因特异性引物，来确认基因型和 DNA 序列。在某些情况下，如 loxP 距离较大或存在重复序列特征时，会应用 Southern blot 和基因组定量 PCR，以避免重复和随机插入。虽然基因分型方案中的引物序列均经过验证，但由于基因编辑结果的复杂性，即便 DNA 序列确定，也不能保证每个品系都如预期发挥功能，因此强烈建议在大规模和长期应用前，对品系的等位基因功效进行验证，包括但不限于在 mRNA 和蛋白质水平检测靶基因表达。

Cre 重组酶品系验证：效率及其他

携带 Cre 重组酶基因的小鼠，是实现条件性敲除不可或缺的工具，需与 cKO flox 品系配合使用。目前，NRCMM 已构建 245 种表达 Cre 重组酶的品系，并根据 Cre 表达的组织 / 细胞类型分类，方便在网站（https://www.gempharmatech.com/product/cre-dre.html）检索。

为确认这些小鼠品系中 Cre 的组织特异性表达，将其与 B6-G/R 报告品系杂交，该报告品系携带经 Cre 重组激活的荧光蛋白表达盒（Hipp11（H11）-CAGloxP-zsGreen-stop-loxP-tdTomato 品系，www.gempharmatech.com/product/details100035_3692348.html）。随后进行免疫组织化学、流式细胞术、定量 PCR 和蛋白质免疫印迹等分析。

Cre 品系的验证流程如下：收集每个 Cre 和报告双阳性小鼠的主要组织和器官，包括心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、大脑、小肠、大肠、胃、棕色脂肪组织、白色脂肪组织、生殖器官和精液（雄性），用于基因组 DNA 提取和 OCT 包埋，以 B6-G/R 小鼠样本作为对照。对于 CreER 品系，部分双阳性小鼠在终点前用他莫昔芬处理，未处理小鼠作为对照。通过 PCR 和定量 PCR 分析基因组 DNA 样本，评估报告等位基因的 loxP 重组效率；冰冻切片用于组织学分析；对于在免疫细胞中有潜在 Cre 活性的品系，采用流式细胞术检测外周血和脾脏样本中主要免疫细胞类型的报告荧光。最后汇总每个品系的所有数据，评估其适用性：若品系在所有预期组织和器官中显示出显著效率，且在不超过 2 个非预期器官中有显著重组，则认为该品系通过验证。成像和流式细胞术数据汇总在网站相应品系的基本信息页面的品系信息文件中。在特殊情况下，若结果不明确，会进行报告基因的放大免疫染色以增强信号强度，有时还会通过蛋白质免疫印迹检测特定器官中的 Cre 或 CreER 蛋白作为补充证据。

在已验证的 112 种 Cre 品系中，29 种未通过检测被从目录中移除，83 种被确认为适用。Cre 品系通过不同策略构建，包括转基因（transgenesis，TG）、插入内源性开放阅读框（在 ATG 后或终止密码子前），或在安全港位点（如 Gt (ROSA) 26 或 H11 位点）敲入（knock in，KI）启动子和编码序列。研究发现，H11 KI 和 TG 策略构建的异常品系比例高于平均水平，表明插入位点的差异可能显著影响 Cre 表达的效率和特异性。29 种异常品系未通过验证的主要原因包括效率有限、重组酶特异性差、诱导型 CreER 品系在未使用他莫昔芬时具有显著 Cre 活性，以及严重的生殖系活性。此外，还终止了 3 种理论上具有组织特异性的 Cre 品系的分发，因其在雄性和雌性小鼠中均存在严重的生殖系活性。对其他 48 种品系精子中的 Cre 活性检测发现，27% 的品系显示出不同程度的精子 Cre 活性。

KOAP 资源库的应用：罕见遗传病模型

罕见病发病率极低，约 80% 由遗传缺陷引起，属于遗传病，其中多数突变是功能丧失或功能减弱型。目前，已知罕见病中仅有不到 10% 可通过药物治疗，部分原因是对疾病病理和潜在生物学机制了解有限。动物模型对于阐明罕见遗传病的遗传和分子机制，以及评估新疗法的疗效至关重要。由于人类基因组和小鼠基因组具有高度同源性，NRCMM 的 KOAP 资源库可作为部分罕见病模型的资源。通过比较基因同源性和分子病理学，估计 KOAP 资源库可覆盖罕见病目录中 140 多种疾病。由于部分目录疾病未区分亚型，不同亚型可能与不同致病基因相关，一种疾病可能对应两到三种模型。因此，已开发 200 种 KO 品系，模拟 140 种由基因功能丧失引起的目录疾病，如酪氨酸血症、法布里病、血友病等。

已在 KOAP 资源库中验证了约 60 种与 34 种主要罕见遗传病相关的模型，包括 40 多种 KO 品系和 5 种 cKO 品系。多数品系是代谢疾病模型，如尿素循环缺陷、氨基酸分解代谢受损、家族性肝内胆汁淤积、溶酶体贮积病等。其他品系包括地中海贫血和血友病模型，适用于细胞和基因疗法测试。还有一些条件性敲除模型，可避免常规 KO 品系的致死表型，如 I 型糖原贮积病（G6pc cKO）、常染色体显性多囊肾病（Pkd1 cKO），以及尿素循环中的几乎所有靶点（Otc、Ass1、Arg1、Cps1 等的 cKO），通过使用泛表达或肝脏特异性 CreERT2 品系进行繁育。基于 KOAP 扩展罕见遗传病资源，将为开发针对这些疾病的新疗法和药物提供支持。

免疫系统重建模型：NCG 免疫缺陷小鼠及衍生品系

NRCMM 开发的 NCG 品系是一种严重免疫缺陷小鼠模型，在 NOD/ShiltJGpt 背景下，敲除 Prkdc（Protein kinase, DNA activated, catalytic polypeptide）和 IL2Rγ（Common gamma chain receptor）基因构建而成。Prkdc 是 B 细胞和 T 细胞发育过程中 V (D) J 重组所必需的，IL2Rγ 是多种白细胞介素细胞因子受体（包括 IL-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15 和 IL-21）的共同亚基。因此，NCG 品系在 T 细胞、B 细胞和 NK 细胞方面存在多种缺陷。其血液学参数和体重变化记录在补充表 1 和补充表 2 中，广泛的表型验证实现了对 NCG 模型严格的质量控制。这些特性使 NCG 成为细胞来源的异种移植（cell-derived xenograft，CDX）/ 患者来源的异种移植（patient-derived xenograft，PDX）的理想模型，可用于多种癌症研究，如胶质母细胞瘤、卵巢癌、膀胱癌、肺癌、胰腺癌和急性髓细胞白血病。此外，NCG 模型还在构建人源化免疫系统（humanize immune system，HIS）和评估 CAR-T 疗法中发挥重要作用。

基于免疫缺陷的 NCG 小鼠，开发了多种表达额外人类基因的 NCG 衍生品系：

• NCG-M 小鼠：表达 SCF、GM-CSF、IL-3 三种人类细胞因子，可更好地促进人 CD34?造血干细胞（hematopoietic stem cell，HSC）移植后髓系细胞和淋巴细胞的发育和扩增。HSC-NCG-M 免疫细胞重建小鼠已用于构建自身免疫性疾病模型，如系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）小鼠模型（由 TLR7 激动剂诱导 pDC 细胞活化）和关节炎小鼠模型（由 CFA 诱导巨噬细胞活化），相关人源化免疫系统诱导的自身免疫性疾病模型列于补充表 3。

• NCG-hIL15 或 NCG-hIL2 小鼠：分别表达人类细胞因子基因 IL15 或 IL2，在人外周血自然杀伤细胞（human peripheral blood natural killer cells，huPBNK）或人 CD34? HSC 移植后，对人类 NK 细胞的定植和活性有显著支持作用。这些模型已成功应用于利妥昔单抗（Rituximab）和马格妥昔单抗（Margetuximab）等抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）药物的临床前评估。此外，NCG-hIL15 小鼠还被报道可用于构建由患者来源的外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）诱导的糖尿病模型。

• NCG-MHC-dKO 小鼠：敲除 MHC I 类和 II 类基因（H2k1、H2d1 和 H2Ab1），以避免人 PBMC 移植后发生急性异种移植物抗宿主病（xenogeneic graft-versus-host disease，GvHD）。类似的 MHC 敲除小鼠，如 NSG-MHC-DKO 已用于评估治疗相关的细胞因子释放综合征（cytokine release syndrome，CRS），MHC 双敲除（double knockout，dKO）NOG 小鼠已用于研究 PD-1/PD-L1 抑制剂的抗肿瘤活性。

• NCG-X 小鼠：c-KIT 基因存在 W41 点突变，可支持人 CD34? HSC 移植，尤其是人类红细胞的重建，且无需进行骨髓消融。NCG-X 小鼠已用于 β- 地中海贫血、缺氧和肿瘤机制的研究。

• NCG-M/hIL15 小鼠：拥有 SCF、GM-CSF、IL3 和 IL15 四种人类细胞因子基因，在人 CD34? HSC 移植后，能更好地促进髓系细胞、T 细胞和 NK 细胞的扩增。

• NCG-hIL6 小鼠：可改善 T/B 细胞分化和抗原特异性免疫应答。

• NCG-mTslp 小鼠：能加速小鼠淋巴组织的恢复，提高抗原特异性免疫应答。

此外，还在开发多种新一代 NCG 品系，旨在更好地重建人类巨噬细胞、中性粒细胞和红细胞系细胞，这些新品系将在免疫肿瘤治疗、自身免疫性疾病和贫血研究，以及人类造血和免疫系统研究中具有更广泛的应用。

疾病模型：自发性疾病的遗传模型

自身免疫性疾病模型

• 系统性红斑狼疮（SLE）模型：SLE 的发病机制与针对核酸和核酸结合蛋白的自身抗体，以及 I 型干扰素（IFN）信号通路密切相关。开发的转基因小鼠品系 B6-hBAFF-Tg（T036794），过表达人类 BAFF，该小鼠从 6 周龄开始自发发展为 SLE，血清 IgG、IgA、IgM 和抗双链 DNA 抗体水平显著升高，B 细胞过度反应，肾脏出现严重炎症浸润。此外，Trex1 基因是 DNA 3' 外切核酸酶，可降解细胞质 DNA，是 DNA 刺激的干扰素通路（ISD）的关键负调节因子。开发的 Trex1??小鼠（T013987），其主要表型与文献报道一致，Trex1 缺陷导致内源性双链 DNA 过度积累，cGAS-STING 信号通路异常激活，诱导 IFN-I 产生，最终导致致命的自身免疫性疾病。

• 免疫相关肾病（IRN）模型：免疫相关肾病是一种以免疫病理特征为主要表现的肾小球肾炎，由过度的免疫反应引起。其亚型包括免疫球蛋白 A 肾病（IgA nephropathy，IgAN）和 C3 肾小球病（C3 Glomerulopathy，C3G）等。

• IgAN 模型：IgAN 是全球最常见的肾小球肾炎，患者循环中的 IgA 抗体与髓系 IgA 受体 FcαRI/CD89 复合物，被认为是系膜沉积的特定致病因素。通过构建表达人类 IgA1 的 B6-hIGHA1 小鼠和在 CD14 基因启动子下表达人类 CD89 的 B6-Cd14-hCD89 小鼠，并将两者杂交得到 B6-Cd14-hCD89/hIGHA1 小鼠（T057918）。该小鼠在 3 周龄左右出现自发死亡，雌性尤为明显。7 周龄起，雌性小鼠与野生型小鼠相比，出现持续的低尿总蛋白泄漏（UPCR）。21 周龄雌性小鼠肾小球中可见明显的 hIgA 沉积，27 周龄时出现多种肾脏病变。

• C3G 模型：C3G 是一种由补体替代途径（alternative pathway，AP）失调激活引起的免疫介导的肾脏疾病。开发的 B6-hC3 人源化小鼠品系，在 C57BL/6JGpt 背景下，利用细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）转基因技术构建，可同时表达小鼠和人类 C3 蛋白。由于小鼠负补体调节因子无法调节引入的人类 C3 蛋白，导致人类 C3 持续转化形成膜攻击复合物，引发 C3G 表型。雄性 B6-hC3 小鼠在生命早期出现发病症状，伴有肾脏、肝脏和心脏损伤、肾性贫血、肾脏病变等与 C3G 患者相似的病理特征。用针对补体因子 B 的小分子抑制剂治疗，可产生治疗效果，突出了替代途径过度激活在驱动这些小鼠病理过程中的作用。

其他疾病模型

除自身免疫性疾病模型外，还建立了神经退行性疾病、自发性肿瘤和代谢综合征等动物模型，这些模型为开发治疗此类疾病的药物提供了理想的临床前平台。

野生小鼠染色体替代系

目前常用的实验室小鼠品系大多在近百年前建立，在近交过程中，野生小鼠的许多重要遗传性状被人工选择淘汰。例如，常规笼养小鼠食物充足但活动空间受限，却未出现野生小鼠在类似情况下预期的肥胖或心血管疾病。因此，当前的近交系小鼠可能难以完全模拟多基因基础的复杂疾病，且某些表型可能因与遗传背景的相互作用，仅出现在特定小鼠品系中。

为解决这些问题，多种策略被开发用于改进小鼠模型，以定位人类疾病的数量性状基因座（quantitative trait loci，QTLs）。如复杂性状联盟提出的协作杂交（Collaborative Cross，CC）项目，旨在通过随机组合 8 种现有近交系小鼠（来自三个主要小鼠亚种：M. m. castaneus、M. m. domesticus 和 M. m. musculus，称为奠基品系）的遗传多样性，产生 1000 多种重组近交系。然而，截至 2019 年，由于高不育率和其他问题，只有 100 种 CC 品系在近交过程中存活下来。尽管如此，CC 品系已成功应用于代谢、病原体免疫等复杂性状的遗传研究。杂交小鼠多样性面板（Hybrid Mouse Diversity Panel，HMDP）是另一组约 175 种特征明确的近交系小鼠，包括 30 种经典近交系和 145 种重组近交系，展现出与人类疾病相关的心血管代谢表型的显著多样性。此外，远交群小鼠（outbred mice stocks，OS）也是维持特定遗传多样性的重要资源，可用于定位与疾病易感性、耐药性和对环境应激反应相关的 QTLs，但使用前需对每只小鼠进行高密度基因分型，增加了育种成本。

与上述基于异质背景的模型不同，染色体替代系（consomic strains，也称为 chromosome substitution strains，CSSs）是通过将供体品系的一对同源染色体转移到受体品系构建而成。除来自<

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