通过单细胞 DNA 测序精准测量 CRISPR 基因编辑结果：为基因和细胞治疗筑牢安全基石

《Molecular Therapy Methods & Clinical Development》：Precise measurement of CRISPR genome editing outcomes through single-cell DNA sequencing

这篇研究利用 Tapestri 单细胞测序技术，深入分析 CRISPR 基因编辑产物。研究发现编辑细胞存在异质性，该技术能精准测量编辑结果，评估脱靶活性和易位等，为基因和细胞治疗的安全性与有效性评估提供关键支持，助力开发更可靠的治疗药物。

　　

一、研究背景

CRISPR-Cas 技术为人类疾病治疗开辟了新方向，通过定制的 20-bp 引导 RNA（gRNA）和 Cas 核酸内切酶，能精确修饰目标基因组区域。DNA 双链断裂（DSB）可由细胞内 DNA 修复机制修复，非同源末端连接（NHEJ）常导致插入和缺失（indels），用于诱导功能丧失（LOF）或获得功能突变；同源定向修复途径则介导位点特异性基因校正和大转基因序列的精确导入。

然而，基因编辑存在脱靶活性风险，可能导致不良甚至致癌的核酸酶诱导 indels 以及结构变异（SVs），包括易位、长缺失、倒位等。当前检测脱靶位点的方法各有局限性，如基于细胞的方法可能遗漏真正的脱靶位点，无细胞检测虽敏感但会产生过多潜在脱靶命中，计算机模拟工具依赖序列同源性筛选。传统批量测序方法虽能量化不良编辑效应，但无法在单细胞水平分辨编辑结果，如无法检测多靶点编辑时的共发生情况和编辑的杂合性。单细胞 DNA 测序（scDNA-seq）可克服这些局限，Tapestri 作为一种 scDNA-seq 技术，能对基因组编辑的人类细胞进行全面评估。

二、研究方法

1. 单细胞 DNA 和蛋白质样本制备与测序：使用 Mission Bio 的 Tapestri 平台，其 V3 化学技术优化了液滴 PCR 扩增和细胞捕获。针对目标位点设计靶向测序面板，通过微流控两步工作流程，包括细胞封装、条形码标记、多重乳液 PCR 和二代测序（NGS）文库制备。在 DNA 加蛋白质工作流程中，细胞用抗体 - 寡核苷酸偶联物（AOCs）染色后进行测序。
2. 构建同基因 CRISPR 编辑克隆细胞系：利用 Synthego 生成靶向 PDCD1 和 TCRA 的 CRISPR-Cas9 编辑的 Jurkat 细胞系，经单细胞分离和克隆扩增后，通过 Sanger 测序和批量 NGS 鉴定编辑事件和基因型。
3. 评估 Tapestri 基因编辑（GE）管道性能：将管道判定的潜在编辑位点的编辑状态与已知真实状态进行比较，根据不同的判定结果（真阳性 TP、真阴性 TN、假阳性 FP、假阴性 FN）计算灵敏度、特异性、假阳性率（FPR）、假阴性率和准确性等性能指标。
4. 蛋白质读取归一化与 DNA 编辑状态分析：对蛋白质读取计数进行归一化处理，去除噪声细胞后，通过 Louvain 方法聚类细胞并注释细胞类型，结合基因编辑状态信息分析不同编辑状态下的蛋白质表达差异。
5. 单细胞数据分析与变异检测：利用 Tapestri GE 管道处理测序数据，进行适配器修剪、细胞条形码提取和校正、读段比对到基因组和细胞识别。通过检查嵌合读段识别易位事件，应用 GATK 最佳实践工作流程进行变异检测和基因分型，并对变异进行筛选和分类。
6. 获取和编辑原代 T 细胞样本：从人外周血单个核细胞（PBMCs）中分离 T 细胞，激活培养后进行编辑。通过电穿孔将 gRNA 和 Cas9 的核糖核蛋白（RNP）复合物导入细胞，培养一定时间后收获细胞进行后续分析。
7. 设计 PDCD1、TCRA 和 TCRB 脱靶面板：通过 GUIDE-seq 实验和 rhAmpSeq 靶向扩增确定潜在脱靶位点，设计包含靶位点和脱靶位点的 115 重定制面板用于 Tapestri 和 rhAmpSeq 检测。
8. 进行群体水平的靶位点和脱靶测量：利用 rhAmpSeq 多重 PCR 测定批量细胞群体中的靶位点和脱靶 CRISPR 活性，通过 CRISPECTOR 软件分析 indel 百分比和检测易位。

三、研究结果

1. 单细胞水平测量 CRISPR 编辑结果：Tapestri 平台能在单细胞水平有效表征 CRISPR 编辑细胞产物，对同基因克隆 Jurkat 细胞系的检测显示，该平台的 GE 管道具有高灵敏度（99.77%）、特异性（99.93%）和准确性（99.92%），低 FPR（0.07%）和 FNR（0.23%）。
2. 直接测量单细胞编辑基因型和功能结果：Tapestri 的 DNA + 蛋白质工作流程可报告每个细胞的编辑共发生、杂合性和表面蛋白表达。对混合细胞样本的分析表明，该流程能准确量化细胞表面蛋白和基因组编辑，验证表面蛋白敲除（KO），并深入了解编辑细胞的性质和状态。
3. 单细胞测序评估原代人细胞中多重 CRISPR 编辑疗效：在原代 T 细胞编辑实验中，单细胞测序和传统批量测序（rhAmpSeq）在大多数靶位点的编辑频率具有一致性，但在 PDCD1 位点存在差异。单细胞测序还能提供编辑杂合性、共发生情况和所需细胞群体比例等额外信息。
4. 通过 scDNA-seq 全面表征基因型和编辑结果：测量编辑位点的杂合性发现，编辑活性高的 gRNA 对应的双等位基因编辑细胞比例更高。编辑事件在靶位点上基本独立，批量数据在一定程度上可推断编辑结果亚群比例，但单细胞分析更能准确评估复杂多靶点编辑的效率。
5. 原代人细胞中多重 GE 产生异质性编辑结果：评估 gRNAs 的脱靶活性发现，部分脱靶位点存在编辑活性，且编辑结果具有高度异质性，每个细胞几乎都有独特的编辑谱。
6. 单细胞测序支持定量易位检测：单细胞测序可检测到易位事件，包括新的易位，且在检测低频易位方面可能优于批量测序。约 1% 的编辑细胞存在易位，不同供体的易位频率和类型有所不同。
7. 整合 scDNA-seq 和蛋白质组分析验证编辑原代细胞的功能 KO：对原代 T 细胞不同时间点的编辑分析表明，编辑率随时间变化，蛋白质表达变化与基因型相关。携带双等位基因移码（FS）indel 的细胞中，TCRα/β 表达下降，验证了基因型与功能 KO 的相关性。

四、研究讨论

1. 技术优势与局限：Tapestri 技术能全面评估编辑细胞的疗效、安全性和功能，但在检测某些位点时，因扩增子设计等问题可能影响结果准确性，需优化设计。批量测序虽高效经济，但无法全面准确评估编辑结果，scRNA-seq 虽有优势但局限于编码区，Tapestri 技术则提供了更全面的解决方案。
2. 编辑异质性与风险：编辑过程存在异质性，可能导致突变克隆的克隆扩增，带来基因毒性风险。纵向研究可深入了解克隆性动态，监测细胞群体稳定性，确保治疗的安全性和有效性。
3. 与其他技术对比：与其他检测易位的方法相比，Tapestri 能检测到更多类型的易位，但基于扩增子的方法局限于多重扩增子内的位点。Tapestri 还可潜在检测其他不良效应，有待进一步研究验证。
4. 技术应用建议：Tapestri 技术在实验设计时需进行脱靶检测或预测，以设计定制面板，且当前技术在检测位点数量和成本方面有一定限制，适用于特定目标的高通量单细胞分析。

五、研究结论

本研究凸显了 scDNA-seq 技术在提升基因编辑（GE）产品精度方面的巨大潜力。通过单细胞分辨率全面分析靶位点和脱靶效应，该技术能更准确地表征编辑细胞，为评估基因组工程疗法的疗效和安全性提供有力支持，推动基因和细胞治疗药物向更可靠、更有效的方向发展。