荧光相关光谱用于粒子尺寸测定：挑战与突破 —— 为生物分子研究开启新视角

《Biophysical Journal》：Fluorescence Correlation Spectroscopy for particle sizing: A notorious challenge

在生物系统定量研究中，精确测定粒子尺寸至关重要，荧光相关光谱（FCS）虽有优势却未成为常规方法。研究人员开展 FCS 在多分散样品应用的研究，讨论其面临的挑战、进展及应对策略，有望推动 FCS 技术更广泛应用。

　　在生物系统的研究领域，许多定量研究都对粒子尺寸的精确测定有着极高的要求。比如在探索生物分子间的相互作用时，粒子尺寸的变化可能意味着分子结合或解离；研究生物分子的组装和解聚过程，粒子尺寸更是关键参数；还有在研究纳米颗粒作为药物载体时，其大小直接影响药物在体内的分布和被靶细胞摄取的效率 。然而，现有的粒子尺寸测定方法都存在各自的问题。动态光散射（DLS）虽然应用广泛，但在复杂环境中检测小粒子时，容易受到背景干扰。而荧光相关光谱（FCS），虽理论上对分子扩散特性具有极高灵敏度，能更精准地测量小的自由扩散粒子尺寸，且具有高信噪比、可用于多色实验等优势，却一直未成为粒子尺寸测定的常规技术。这是因为它对信号干扰过于敏感，在实际操作中容易产生误差。

为了解决这些问题，来自德国马克斯?普朗克生物化学研究所（Department of Cellular and Molecular Biophysics, Max Planck Institute of Biochemistry）以及卓越集群 ORIGINS（Exzellenzcluster ORIGINS）的研究人员 Jan - Hagen Krohn、Adam Mamot 等人开展了关于 FCS 在多分散样品中应用的研究 。他们的研究成果发表在《Biophysical Journal》上，为 FCS 技术的应用提供了新的思路和方法，有望推动该技术在粒子尺寸测定领域的广泛应用。

研究人员在研究中主要运用了以下几种关键技术方法：

1. 荧光相关光谱技术（FCS）：利用激光激发附着在粒子上的荧光染料，通过分析荧光发射随时间的相关性，获取粒子的扩散动力学信息，进而推断粒子尺寸。
2. 共聚焦显微镜技术：提供了小且相对明确的检测体积，方便进行 FCS 测量。研究中涉及多种基于共聚焦显微镜的 FCS 测量模式，如单光斑 FCS、双焦点 FCS、扫描 FCS 等。
3. 数据分析方法：包括对自相关函数（ACF）的拟合分析，以及使用如最大熵方法（MEM）、最小二乘二阶导数法（CONTIN）等对数据进行处理，同时探索了机器学习方法在 FCS 数据分析中的应用。

研究结果如下：

1. FCS 与 DLS 的优势对比：FCS 因荧光标记具有高信噪比，能在复杂环境（如完整细胞甚至生物体）中进行测量，且可用于多色实验（如荧光交叉相关光谱，FCCS）研究分子间相互作用。同时，FCS 适用于研究小粒子或成分未知的样品，而 DLS 在检测小粒子时受背景影响较大12。
2. FCS 在实际应用中的限制：FCS 未被广泛应用的原因包括其发展滞后于 DLS，且荧光标记带来诸多问题。如荧光激发 / 发射光循环的饱和过程限制了信噪比的提高，还可能导致粒子尺寸的高估；光化学副反应会引起荧光团的开关变化，光漂白会降低信噪比、引入额外的慢扩散动力学，导致粒子尺寸的低估，且这些影响难以预测和平衡34。
3. 大粒子对 FCS 和 DLS 的影响及应对策略：大粒子在 FCS 和 DLS 数据中存在过度代表性的问题，会干扰对多分散样品粒子数分布的准确获取，且其动力学易被高噪声掩盖。可采取丢弃异常信号、稀释荧光标记单体等方法应对，但这些方法也存在一定局限性。此外，当粒子尺寸较大时，还需对相关公式进行修正以减少对有效扩散时间和粒子数的影响56。
4. FCS 实验技术的新进展：除传统单光斑共聚焦 FCS 外，多焦点 FCS（如双焦点 FCS）、扫描 FCS 等新技术不断涌现。这些技术在提高分析的稳健性、增加粒子通量、适应不同扩散系数样品等方面具有优势，同时 FCS 自动化也取得了一定进展78。
5. FCS 数据分析策略：对于多分散样品的 FCS 数据分析，简单的单组分或双组分拟合难以准确反映粒子数分布。通过结合标记影响模型和粒子迁移率模型，可减少模型参数，利用 “直方图法” 结合合适的拟合约束条件进行分析。此外，光子计数直方图等替代数据分析框架虽能解决一些拟合模糊问题，但计算成本较高。而机器学习（如卷积神经网络，CNN）在 FCS 数据分析中展现出潜力，能利用原始数据弥补 ACF 分析丢失的信息910。

研究结论和讨论部分指出，尽管 FCS 目前因多种实际原因尚未成为常规粒子尺寸测定的首选方法，但在有效处理主要误差来源的情况下，其表现良好。研究人员强调仪器开发者应重视 FCS 技术，尤其是结合机器学习在数据分析中的巨大潜力，使 FCS 成为更易获取的技术，为分子尺寸的大规模分析提供新视角。在 - omics 时代，粒子尺寸和扩散系数作为重要的互补参数，对于在细胞范围内绘制动态蛋白质组和相互作用组具有重要意义，有望推动对生命系统的整体理解迈向新高度。