Cryo-EM 解析蛋白孔结构：胆固醇簇与膜脂的多样作用探秘

在解析膜蛋白与脂质相互作用面临挑战的情况下，研究人员以珊瑚来源的 Actinoporin（Fav）为对象开展跨膜孔相关研究。结果发现 Fav 孔与多种脂质相互作用，胆固醇影响脂质排列和孔结构。这为理解膜蛋白和脂质行为提供了依据。

　　在生命科学领域，细胞膜对于生物体的正常运作至关重要，众多膜相关蛋白是重要的药物靶点。然而，由于蛋白质 - 脂质相互作用的复杂性以及脂质分子的动态特性，高分辨率下确定蛋白质 - 脂质相互作用成为一大挑战。尽管冷冻电镜（cryo-EM）技术的进步使已知的膜蛋白与相关脂质的结构数量有所增加，但对于膜蛋白周围脂质的组织方式以及膜蛋白如何影响脂质排列等问题，仍有待深入研究。在此背景下，来自斯洛文尼亚国家化学研究所（National Institute of Chemistry, Ljubljana, Slovenia）的研究人员开展了一项研究，相关成果发表在《Nature Communications》上。

为探究膜蛋白与脂质的相互作用，研究人员以珊瑚 Orbicella faveolata 中一种成孔毒素 fragaceatoxin C（FraC）的同源物 Fav 为研究对象。他们运用了多种关键技术方法，其中 cryo-EM 技术用于解析与跨膜孔相关的脂质分子的原子模型，分子动力学（MD）模拟则辅助验证结合的脂质分子，并阐明蛋白孔对周围脂质分子的影响。

研究结果如下：

1. 可溶性 Fav 孔的制备：Fav 具有独特的 N - 和 C - 末端延伸，研究人员结晶并确定了截短 53 个 N 末端残基的单体 Fav（ΔN53Fav）的晶体结构。通过将单体野生型 Fav 与 1,2 - 二油酰 - sn - 甘油 - 3 - 磷酸胆碱（DOPC）：鞘磷脂（SM）1:1（mol:mol）的大单层囊泡（LUVs）孵育制备 Fav 孔，并利用离子交换色谱法分离和浓缩。
2. Fav 孔的冷冻电镜结构：3D cryo - EM 重建显示，Fav 孔为漏斗形跨膜通道，由八个两亲性 α1 - 螺旋组成，嵌入由洗涤剂和残留脂质构成的胶束中。研究人员在 Fav 孔中观察到 6 种脂质（L1 - L6），它们通过氢键、阳离子 - π 相互作用和疏水相互作用与蛋白质结合，形成稳定的蛋白 - 脂质孔复合物。
3. 胆固醇对 Fav 孔的影响：胆固醇增强了 actinoporins 的活性，研究人员使用 POPG 替代 DOPC，制备了含有胆固醇的 Fav 孔。cryo - EM 重建发现，胆固醇在 Fav 孔帽下形成有序的纳米域，使脂质排列更有序。此外，胆固醇略微影响跨膜螺旋的位置和离子电流，且 SM 优先结合在 Fav 孔的 L1 - L5 位置。
4. Fav 孔对膜脂质的影响：MD 模拟表明，Fav 孔周围的脂质分子相对运动在膜的上叶比下叶更相关，上叶脂质扩散更慢。同时，Fav 孔的存在影响了未结合脂质的侧向扩散常数。

研究结论和讨论部分指出，Fav 孔的 cryo - EM 结构揭示了蛋白质与脂质相互作用的一般原则，不同脂质在 Fav 孔中具有不同功能。结构脂质 L1 和 L6 是寡聚孔结构的重要组成部分，受体脂质 L2 - L5 可被 SM 或 PC 结合，胆固醇纳米域稳定了孔周围的磷脂。此外，Fav 表面能特异性结合多个 SM 头基团，增强了蛋白质与脂质膜的结合稳定性。胆固醇虽不是 Fav 孔形成的必需因素，但它促进了脂质与孔的紧密结合，稳定了孔在膜中的结构。该研究有助于更全面地理解膜蛋白和脂质在膜中的行为，突出了膜脂质的重要结构和功能作用，同时也为生物纳米孔在生物技术领域的应用提供了新的理论基础。