结构探秘：二聚同化型 NADPH 依赖型亚硫酸盐还原酶揭示二黄素还原酶结合的最小界面

《Nature Communications》：Structure of dimerized assimilatory NADPH-dependent sulfite reductase reveals the minimal interface for diflavin reductase binding

在生物学研究中，大肠杆菌 NADPH 依赖型同化亚硫酸盐还原酶（SiR）的亚基结合机制长期未知。为解决此问题，研究人员开展 SiR 的结构研究。他们利用特殊技术确定了最小异源二聚体复合物的近原子分辨率结构，揭示了亚基结合界面，为相关研究提供关键信息。

　　在微观的生命化学工厂里，有一种神奇的 “小机器”—— 大肠杆菌 NADPH 依赖型同化亚硫酸盐还原酶（SiR），它肩负着重要使命：将亚硫酸盐（SO32??）通过六电子还原转化为硫化物（S2?），为含硫生物分子的合成提供原料 。SiR 由两个亚基组成，一个是结合 NADPH、FMN 和 FAD 的二黄素黄素蛋白（SiRFP），另一个是含有西罗血红素（siroheme）/Fe4?~S4?簇的血红素蛋白（SiRHP）。然而，自 SiR 被发现 50 多年来，其亚基之间的分子相互作用一直是个谜。这是因为 SiR 结构灵活，传统的高分辨率结构分析方法难以施展拳脚，就像用一把钝刀去精细雕刻，根本无法完成任务。所以，对 SiR 结构和功能的深入理解受到了极大阻碍，这也限制了相关领域的进一步发展。

为了攻克这个难题，来自佛罗里达州立大学（Department of Biological Science and Institute of Molecular Biophysics, Florida State University）和纽约结构生物学中心（New York Structural Biology Center）等机构的研究人员踏上了探索之旅。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为我们揭开了 SiR 的神秘面纱。

研究人员主要运用了冷冻电镜（cryo-EM）技术来解析 SiR 的结构。在实验过程中，他们面临着样品制备的难题，传统方法会导致 SiR 在空气 - 水界面变性。为此，他们巧妙地将变色龙（chameleon?）快速冷冻系统与氟化脂质相结合，成功克服了这一障碍，使得 SiR 能够以完整的状态被观察。

下面来看看具体的研究结果：

• SiRFP 与 SiRHP 结合敏感性：研究人员从三种修饰的最小二聚体入手，分别是 SiRFP - 43/SiRHP、SiRFP - 60/SiRHP 和 SiRFP - 60X/SiRHP。这些变体对传统的冷冻电镜制样方法极为敏感。经过大量尝试，研究人员发现将高临界胶束浓度的氟化脂质 fos - choline - 8（FF8）与 chameleon? 系统相结合，能有效避免样品在空气 - 水界面变性，保留完整复合物，为后续研究奠定基础。
• SiRFP - SiRHP 结合界面：研究发现，SiR 十二聚体全酶质量约 800kDa，而最小 SiRFP/SiRHP 二聚体的结合界面却很小，仅占溶剂暴露表面的 2.6%。该界面主要由 SiRHP 的 N 端区域主导，通过 π - 阳离子相互作用、疏水作用和平面堆叠等方式与 SiRFP 的 FNR 结构域紧密结合。例如，SiRHP 的 h - Lys73 与 SiRFP 的 f - His258 之间形成 π - 阳离子相互作用，同时还有多个疏水残基参与，共同稳定了二聚体结构。
• 与其他电子载体结合差异：与一些利用铁氧还蛋白（Fd）作为电子载体的生物不同，大肠杆菌中 SiRFP 与 SiRHP 的结合稳定且结构独特。通过对比玉米（Zea mays）中 SIR 与 Fd 的结合结构，研究人员发现 SiRHP 中一段特定的环结构与 SiRFP 的结合密切相关，而这段环在与 Fd 结合时则发挥不同作用，决定了电子转移伙伴的特异性。
• SiRHP 活性位点构象：当 SiRHP 与 SiRFP 结合时，其阴离子结合环处于关闭状态，这与游离 SiRHP 的结构不同。这种构象变化受 SiRHP N 端的影响，使得活性位点呈现出一种介于氧化态（结合磷酸）和还原态（结合亚硫酸盐）之间的中间构象，为亚硫酸盐的结合做好准备。
• SiRFP 的结构灵活性：研究表明 SiRFP 的 Fld 结构域相对 FNR 结构域具有高度的移动性。在不同的二聚体变体中，Fld 结构域的位置和运动状态各异。如在 SiRFP - 60Δ/SiRHP 中，Fld 结构域可摆动 20°；在 SiRFP - 60X/SiRHP 中，尽管 Fld 和 FNR 结构域通过二硫键交联，但连接它们的 36 个氨基酸的 linker 依然高度动态，这可能与电子转移过程中 Fld 结构域与 SiRHP 活性位点的相互作用有关。

综合上述研究，研究人员成功解析了大肠杆菌 NADPH 依赖型同化亚硫酸盐还原酶（SiR）最小二聚体的近原子分辨率结构，揭示了 SiRFP 与 SiRHP 之间的结合界面以及结构与功能的关系。这一成果不仅为理解 SiR 的催化机制提供了重要依据，还为研究其他类似的氧化还原酶提供了参考。同时，研究中所采用的技术和方法也为解决蛋白质结构研究中的难题提供了新思路，推动了结构生物学领域的发展。未来，有望基于这些发现，进一步探索 SiR 在生物体内的生理功能，以及开发针对相关代谢途径的调控策略。