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为解决 CRISPR-Cas12a 在基因编辑中脱靶切割及 R 环形成机制不明的问题，研究人员开展了 Cas12a R 环形成动力学和力学的研究。结果发现其 R 环形成有多步中间态，受多种因素影响，相关模型揭示了其活性和特异性的机制，为基因编辑提供理论基础。
在生命科学的基因编辑领域，CRISPR-Cas 系统犹如一把神奇的 “分子剪刀”，能精准地对 DNA 进行切割和编辑，为攻克多种疑难疾病带来了新希望。其中，CRISPR-Cas12a 凭借独特的优势，在基因编辑舞台上备受瞩目。它拥有富含 T 的原间隔相邻基序（PAM） ，具备自主加工前体 crRNA 的能力，还能在切割靶 DNA 后非特异性地切割单链 DNA，在基因组编辑中发挥着重要作用。
然而，这把 “剪刀” 并不完美。CRISPR-Cas12a 存在脱靶切割的问题，即它可能会错误地结合并切割非目标 DNA 序列，这一缺陷严重限制了其在临床治疗和基础研究中的应用。而且，目前对于 Cas12a 识别和结合 DNA 的具体机制，尤其是 R 环形成过程的动力学和力学原理，人们了解得还不够深入。为了深入探究这些问题，来自斯坦福大学、加州大学伯克利分校等机构的研究人员展开了深入研究，相关成果发表在《Nature Communications》上。
研究人员运用了单分子扭矩光谱技术中的金转子珠追踪（AuRBT）方法来开展研究。该技术就像是给微观的 DNA 分子装上了一个 “精密传感器”，能够在碱基对分辨率下，实时监测 Cas12a 与 DNA 相互作用时的动态变化。
研究结果如下：
- AuRBT 测量 dCas12a 的 R 环形成：研究人员利用 AuRBT 实验，通过控制 DNA 的超螺旋状态，观察到在负超螺旋条件下，dCas12a（核酸酶缺陷型 Cas12a）能够与 DNA 结合并形成 R 环，且 R 环形成和坍塌分别发生在负扭矩和正扭矩条件下，而在对照实验中则未出现这些现象。
- Cas12a 直系同源物间 R 环中间体存在差异：高分辨率的 AuRBT 技术揭示了不同 Cas12a 直系同源物在 R 环形成过程中的差异。dAsCas12a 在 R 环形成和坍塌过程中，会出现约 5 bp 的种子中间体和约 17 bp 的远端中间体，且在高负扭矩下 R 环会延伸超过 20 bp；而 dLbCas12a 在形成 20 bp 的 R 环时，在解旋过程中未观察到明显中间体，在重绕过程中则会出现约 17 bp 的离散远端中间体。
- R 环动力学取决于靶序列：研究发现，Cas12a 的 R 环状态景观依赖于靶序列。对于 LbCas12a，不同靶序列的 R 环状态结构差异显著；AsCas12a 在不同靶序列上也存在差异，如在序列 2 上完整或超解旋的 R 环比例更高。
- 错配可使 R 环被困在中间态：通过 AuRBT 实验研究错配对 Cas12a R 环状态结构和动力学的影响，发现错配会破坏 R 环延伸通过错配位置的状态，使 R 环更多地被困在中间态。在不同错配条件下，LbCas12a 和 dAsCas12a 的 R 环中间态分布均发生改变，且负超螺旋能在一定程度上克服错配的影响，促进 R 环的完全形成。
- 四态模型近似描述 R 环形成：鉴于 Cas12a R 环形成的复杂性，研究人员开发了一个四态模型，将 R 环状态分为闭合状态（C - 0 BPU）、种子中间体（I1 - ~5 BPU）、远端中间体（I2 - ~17 BPU）和完全开放的 R 环（O - ~20 BPU）。该模型能够描述 Cas12a R 环形成的大部分行为，错配会使更开放的状态不利，而负扭矩则能克服错配的影响，使平衡常数增加。
- 自由能景观可视化 R 环动力学：通过构建自由能景观，直观展示了扭矩和错配对 R 环形成的综合影响。错配会使远端的 I2 和 O 状态不稳定，而负超螺旋能够克服这种不稳定，使开放状态更容易达到。不同的 Cas12a 直系同源物、靶序列和超螺旋条件下，自由能景观存在差异，体现了 R 环形成的复杂性和多样性。
- 超螺旋促进 Cas12a 的混杂切割：基于上述模型预测，研究人员通过比较野生型 Cas12a 对超螺旋质粒和松弛质粒的切割效率，验证了负超螺旋能够克服错配的影响，使 Cas12a 在存在错配的情况下仍能对超螺旋 DNA 进行切割，从而增加切割的混杂性。
研究结论和讨论部分指出，该研究通过高分辨率的单分子扭矩光谱测量，详细解析了 CRISPR -AsCas12a 和 -LbCas12a 的 R 环形成过程。研究发现了约 5 bp 的中间体，证实了引导 RNA 中预有序核苷酸在 R 环形成初始状态的重要性。四态模型为理解 Cas12a 在超螺旋 DNA 上 R 环形成的偏好性和混杂性提供了理论框架。与 Cas9 相比，Cas12a 的 R 环形成过程更为复杂，能量景观不太有利，这使得其对 R 环的采样更为敏感和可逆，可能是其特异性差异的原因。此外，研究还观察到 AsCas12a 的下游 DNA 呼吸现象，这与 Cas9 不同，且可能与 Cas12a 的切割机制相关。
这项研究不仅揭示了 Cas12a 识别和结合 DNA 的动态基础，为理解其特异性和活性差异提供了关键线索，还为未来优化 Cas12a 的性能、开发更高效精准的基因编辑工具奠定了坚实的理论基础，在基因治疗、疾病研究等领域具有重要的应用前景。
