癌症相关的 SF3B1 突变 K700E 如何广泛改变 U2 / 分支点识别却不影响剪接？—— 探寻髓系肿瘤发生新机制

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Cancer-associated SF3B1 mutation K700E causes widespread changes in U2/branchpoint recognition without altering splicing

本文聚焦髓系发育异常综合征（MDS）及相关癌症中 SF3B1 突变。通过 U2 IP-seq 技术研究 K562 白血病细胞中 SF3B1 K700E 突变，发现其广泛改变 U2 / 分支点（BS）识别，多数变化不影响 3′剪接位点选择，为理解 SF3B1 功能及突变致癌机制提供新视角，值得一读。

　　

研究背景

前体信使核糖核酸（pre-mRNA）剪接是基因表达的关键环节，剪接因子的突变往往会引发多种人类疾病。核心剪接体蛋白 SF3B1 在癌症中频繁发生突变，在髓系发育异常综合征（MDS）患者中，约 30% 存在 SF3B1 突变，其中 K700E 突变占比超 50%。K700E 等 SF3B1 突变会导致在转录组的一小部分内含子中识别隐蔽的 3′剪接位点（ss），并与上游的替代分支位点（BS）相关联。

在剪接体组装早期，SF1、U2AF2、U2AF1 分别识别 BS、多嘧啶序列和 3′ ss 的 AG 二核苷酸，随后招募 U2 核糖核蛋白颗粒（U2 snRNP，U2）形成前剪接体 A 复合物。在此过程中，SF3B1 与 U2AF 及内含子序列相互作用，稳定 U2 与 BS 的结合。K700E 突变会破坏 SF3B1 与剪接因子 SUGP1 的相互作用，影响 BS 识别，不过目前难以直接评估 SF3B1 突变时 BS 的使用情况。

研究方法

研究人员利用 CRISPR 技术构建了两个 K562 髓系白血病细胞系，分别携带野生型（WT）或 K700E 突变的 SF3B1 基因，且融合了 N 端 His₆-FLAG 标签。从细胞中分离细胞核，将高分子量（HMW）核组分和可溶性核质分离，用核酸酶提取染色质结合复合物，对 U2 复合物进行免疫纯化。从 HMW 提取的复合物中分离 RNA，去除 U2 snRNA 后将剩余片段转化为互补脱氧核糖核酸（cDNA）并测序，映射到人类基因组。同时，通过 rMATS 分析替代剪接事件，以 ΔPSI（percent spliced-in）表示剪接变化。

研究结果

1. U2 IP-Seq 识别 MDS 突变细胞中众多分支点识别的变化：从 WT 和 SF3B1-K700E 细胞的 HMW 核组分中纯化的 U2 复合物，包含相似的核心 U2 蛋白以及 RBM5 和 RBM10 蛋白。通过 U2 IP-Seq 分析，发现多数测序读数映射在靠近内含子 3′端的簇中，对应于前催化剪接体保护的 BS。在分析的 156 个替代 3′ ss 事件中，大部分（142 个）在 WT 和 K700E 细胞间存在 BP 选择的变化，多数情况下突变蛋白会转移到上游 BS 并激活上游 3′ ss，少数（42 个）转移到下游 BS 并激活下游 3′ ss。此外，还发现 14 个替代 3′ ss 事件虽有剪接变化，但未检测到 BP 使用的改变，不过部分事件中替代 BP 的读数可能因不丰富未被显著报道。
2. K700E 突变诱导数千个分支点改变而不改变 3′剪接位点：通过严格筛选标准，研究人员发现近四千个在突变细胞中使用频率高于 WT 细胞的 BP，其中绝大多数（98.86%）与替代 3′ ss 激活、盒式外显子或其他替代剪接事件无关，即多数 BP 变化不影响剪接。这些差异使用的 BP 与 WT 细胞中 BP 的距离多数在 1 - 4 个核苷酸，且突变偏好的位点多数在 WT 位点下游。研究还发现，K562 细胞中 U2 snRNA 与 BS 的碱基配对模式相对频率与之前研究不同，且紧密间隔的 BP 对偏好特定的配对模式组合，但突变蛋白偏好的位点对特定配对模式无明显偏向。
3. K700E SF3B1 偏好与 U2 snRNA 配对更稳定或多嘧啶序列更强的分支点：对于 7 - 14 个核苷酸间隔的 WT 和突变 BS，在规范的模式 1 配对中，K700E 细胞中上游偏好的位点与 U2 snRNA 的潜在碱基配对核苷酸更多，而下游偏好的位点虽碱基配对潜力不一定更强，但紧邻更突出的富含 U 的多嘧啶序列。在与替代 3′剪接位点相关的 BS 对中也有类似趋势。

研究讨论

本研究从 K562 白血病细胞中成功分离出携带 WT 或 K700E 突变的 U2 复合物，通过分析其保护的 RNA 片段，比较了 WT 和突变细胞中 U2/BS 的相互作用。研究结果支持 SUGP1/DHX15 促进正确 BS 识别的模型，而非防止错误 BS 使用的模型。同时，发现突变剪接体结合数千个替代 BS，虽多数剪接正常，但这些额外 BS 的使用可能影响细胞信使核糖核酸（mRNA）代谢和基因功能。

K700E 突变细胞中偏好的 BS 具有不同特征，上游位点与 U2 snRNA 碱基配对潜力更强，下游位点紧邻更富含 U 的多嘧啶序列。与其他研究结果的差异，可能反映了髓系和淋巴系细胞早期剪接体组装机制的不同，也可能是研究方法差异导致。

K562 细胞中 K700E 突变模型表明，突变的 SF3B1 缺乏与 SUGP1 的相互作用，需要额外的稳定机制使 U2 结合 BS，可能来自更强的碱基配对或更富含 U 的多嘧啶序列。未来对 MDS 患者组织样本或诱导多能干细胞（iPSCs）衍生细胞进行 U2 IP-Seq 分析，以及研究其他 SF3B1 突变和不同肿瘤类型细胞中 U2 组装的变化，将进一步揭示剪接调控机制及在肿瘤发生中的作用。