快速纳米孔宏基因组游离 DNA 测序诊断血流感染的研究：开拓感染诊断新方向

《Microbiology Spectrum 3.7》：Application of rapid Nanopore metagenomic cell-free DNA sequencing to diagnose bloodstream infections: a prospective observational study

本文聚焦血流感染（BSI），开发利用牛津纳米孔技术平台的宏基因组下一代测序（mNGS）检测血浆微生物游离 DNA（cfDNA）。研究显示其能确认血培养阳性结果，还能在血培养阴性患者中识别病原体，为感染诊断提供新补充，值得关注。

　　### 研究背景
血流感染（BSIs）频发且死亡率高，常发展为败血症。据全球疾病负担研究，2017 年有 5000 万败血症病例和 1100 万相关死亡，近全球死亡总数的 20%。治疗败血症，国际指南建议理想情况下在确诊 1 小时内给予广谱经验性抗菌治疗。但 20% 的病例中经验性抗菌治疗无法覆盖病原体，导致死亡率升高。金标准血培养存在诸多问题，如超过 50% 临床败血症患者无法确诊，可能因先前抗菌治疗或微生物载量低于检测限，且血培养确定病原体需约 2 天，与急需有效抗菌治疗的需求矛盾。这促使新型 BSI 诊断方法的开发，宏基因组下一代测序（mNGS）检测血浆微生物游离 DNA（cfDNA）备受关注，不过其常用平台检测耗时较长。本研究利用实时纳米孔测序平台开发血浆 mNGS 检测方法，并在医院急诊病房进行前瞻性观察研究，与金标准血培养对比评估其性能。

材料和方法

1. 研究设计：在奥尔堡大学医院急诊病房开展横断面研究，该医院为北丹麦地区的参考医院（服务人口约 60 万）。2022 年 6 月 1 日至 12 月 31 日，前瞻性纳入疑似 BSI 患者。每位患者采集 9mL K₂EDTA 血样用于 mNGS，与常规诊断血培养从同一静脉穿刺点采集。同时收集 12 名健康献血者血样作为阴性参考组。
2. 研究人群：纳入标准为因疑似 BSI 入住奥尔堡大学医院急诊病房且申请血培养的患者，患者需意识清醒、定向力正常，能阅读并理解参与者信息。排除标准为年龄小于 18 岁或无法提供书面知情同意书的患者。
3. 患者分组：临床微生物学家根据医疗记录将患者分为血培养阳性（BSI 确诊）、血培养阴性但高度怀疑 BSI（BSI 疑似）、血培养阴性且无感染性疾病怀疑（BSI 排除）、血培养阴性且 BSI 可能性低（BSI 不太可能）四组。选取 BSI 确诊、BSI 疑似和 BSI 排除组患者进行分析，BSI 不太可能组因资金限制未纳入宏基因组测序分析，分析 BSI 排除组以评估特异性。
4. 临床微生物学检测：从患者医疗记录获取临床微生物学结果，不进行后续分析。标准血培养采用两个 BD BACTEC Plus 需氧培养基和一个 BD BACTEC 溶血液厌氧培养基玻璃培养瓶，从外周采集样本后在 BACTEC FX Top 仪器中培养。使用传统生化测试和基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI Biotyper 3.1）进行菌种鉴定，得分≥2 可鉴定到种水平，大肠杆菌根据 CHROMagar 定向培养基上的红色菌落生长和吲哚试验阳性鉴定。
5. 血浆制备和 DNA 提取：在采血 1 小时内，于医院生化科对血样进行离心制备血浆，先以 1600g、4°C 离心 10 分钟，取上清再以 16000g、4°C 离心 10 分钟，新上清液储存于 -80°C。分析时解冻血浆，加入特定单链寡核苷酸用于微生物 DNA 绝对定量，使用 QIAmp MinElute ccfDNA 试剂盒提取 DNA，用 Qubit dsDNA HS 检测试剂盒和 Qubit 4 荧光计定量 DNA，用 D1000 高灵敏度 ScreenTape 检测试剂盒和 TapeStation 4150 评估 DNA 长度。
6. 文库制备和测序：取 10 - 18μL 提取的 DNA 作为 SRSLY DNA NGS 文库制备 PicoPlus 试剂盒的输入，按极端短片段保留方案进行文库制备。使用连接试剂盒（Oxford Nanopore Technologies, SQK - LSK114）为牛津纳米孔测序准备样本，将 4 或 5 个样本多重复用，总输入 DNA 为 200fmol。在 PromethION 24 上的 R10.4.1 流动细胞进行测序，用超精确模型（Guppy 7.0.9）进行碱基识别，质量截断值为 Phred 分数 10。
7. 数据分析和生物信息学：使用 Cutadapt 软件对碱基识别后的读数进行解复用、修剪接头并检查剩余条形码或接头。读数先与人类基因组进行多轮比对，未显著比对的读数再与包含多种微生物基因组的数据库比对。对微生物读数采用最近共同祖先方法重新评估，仅当近最佳比对中超过 50% 匹配同一属时才接受。丢弃基因组覆盖度不均匀的物种读数，根据单链内参定量病原体 DNA，以基因组当量每微升（GPM）表示。
8. mNGS 结果临床相关性评估：由两名临床微生物学家根据患者其他微生物学结果和整体临床情况评估 mNGS 结果的相关性。若 mNGS 鉴定的病原体至少有一种也被血培养鉴定到，则为 “确认”；若至少有一种病原体在疑似感染部位其他样本中鉴定到或与临床情况相符，则为 “可能”；若至少有一种病原体与临床情况一致，则为 “有可能”；若 mNGS 鉴定的病原体与急性感染无关，则为 “不太可能”。
9. 潜在临床影响分析：两名临床微生物学家对比 mNGS 微生物鉴定结果与常规诊断、医疗记录和患者入院前后使用的抗菌药物。因 mNGS 分析为批次进行，影响分析基于潜在实时设置的约 6 小时周转时间。评估三种潜在影响类型：从无效到有效的抗菌治疗改变、增加额外抗菌药物覆盖、延长治疗。仅考虑 mNGS 病原体与急性感染相关的患者。
10. 统计分析：使用 Clopper - Pearson 精确方法计算敏感性和特异性的置信区间，采用双侧 Wilcoxon - Mann - Whitney 检验比较分布，多重比较时用 Holm - Bonferroni 方法调整 P 值。按特定标准判断 mNGS 结果与血培养结果的真假阳性和阴性，所有统计分析在 R（版本 4.2.0）中进行。

研究结果

1. 患者纳入和样本选择：研究期间 186 名患者提供书面知情同意书，最终选取 40 名患者分析，分为 BSI 确诊（n = 11）、BSI 疑似（n = 25）、BSI 排除（n = 4）和 BSI 不太可能（n = 141）四组，5 名患者被排除，仅对前三组进行 mNGS 分析。
2. 患者特征：分析的 40 名患者中 50% 为女性，中位年龄 71 岁。常见感染类型为尿路感染（UTI，n = 12）和下呼吸道感染（LRTI，n = 10）。多数患者有合并症，如糖尿病（n = 13）、癌症（n = 7）和慢性阻塞性肺疾病（n = 5）。BSI 确诊和 BSI 疑似组 C 反应蛋白（CRP）水平显著高于 BSI 排除和 BSI 不太可能组。
3. 临床微生物学结果：BSI 确诊组 11 份阳性血培养中，大肠杆菌（E. coli）7 例，表皮葡萄球菌 2 例，粪肠球菌 1 例，金黄色葡萄球菌 1 例，多为脓毒症患者。BSI 疑似组 25 名患者中，14 名（56%）其他部位培养阳性，病原体包括大肠杆菌 7 例、铜绿假单胞菌 2 例等，其余患者无阳性微生物检测结果指导抗菌治疗。
4. 宏基因组 DNA 测序分析：40 名患者血浆 cfDNA 测序结果显示，平均读长深度为 10.1M 读数，平均 Phred 质量为 19.0，平均读长 N50 为 176bp。BSI 确诊和 BSI 疑似组血浆 cfDNA 水平显著高于献血者。mNGS 确认了所有血培养阳性结果，部分患者还检测到额外病原体。BSI 疑似组 25 名患者中有 12 名检测到病原体，多数与急性感染相关，还有 5 名患者其他微生物检测结果支持 mNGS 发现。BSI 排除组未检测到病原体。与血培养相比，mNGS 在患者水平的敏感性为 100%，特异性为 59%。病原体 DNA 载量为 0.5 - 321GPM，大肠杆菌在 BSI 确诊和 BSI 疑似组的载量无显著差异。
5. 病例系列：选取 BSI 确诊和 BSI 疑似组 mNGS 阳性患者进行详细分析。如 BSI 确诊组的 p001 患者，血培养和 mNGS 均检测到粪肠球菌；p104 患者，血培养和 mNGS 分别检测到表皮葡萄球菌和卡波西肉瘤相关疱疹病毒（KSHV）等。BSI 疑似组的 p128 患者，血培养阴性但 mNGS 检测到肺炎链球菌；p173 患者，mNGS 检测到多种病原体，与之前感染情况相关；p072 患者，血培养阴性但 mNGS 检测到大肠杆菌。
6. 潜在临床影响：对 22 名 mNGS 结果得到确认或被认为相关的患者分析，在实时情况下，mNGS 结果可能影响 13 例（59%）抗菌治疗，包括 5 例从无效到有效的治疗改变、7 例从口服到静脉用药的升级和 1 例增加额外抗菌药物，但因样本量小等因素需谨慎解读。

讨论

本研究表明快速纳米孔 mNGS 可作为血培养的可行补充，能确认所有阳性血培养结果，并在更多患者中提供相关病原体鉴定，适用于多种临床综合征。不过，mNGS 在血培养阴性患者中的结果验证和解释存在困难，可能检测到与急性 BSI 无关的微生物，需谨慎解读。虽然 mNGS 检测成本高，但在特定患者群体中，其高敏感性和快速周转时间可能降低死亡率和住院时间，值得进一步研究。本研究存在局限性，如仅纳入能提供知情同意的患者、非实时分析、样本选择有偏、评估特异性的患者数量不足、检测到多种病原体增加解读难度、无法对不一致结果进行后续微生物检测等。总体而言，本研究为纳米孔 cfDNA 宏基因组学用于 BSI 患者诊断提供了概念验证，鼓励在更大队列中评估和全面验证该方法。