金黄色葡萄球菌生物膜动态、抗生素耐药性研究：揭秘生物膜阶段、ζ 电位变化及抗生素敏感性的关键意义

《Microbiology Spectrum 3.7》：Staphylococcus biofilm dynamics and antibiotic resistance: insights into biofilm stages, zeta potential dynamics, and antibiotic susceptibility

这篇研究聚焦于金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）生物膜感染。通过构建体外实验，明确了生物膜 4 个生长阶段，测定 ζ 电位分析生物膜特性，还评估多种抗生素疗效。研究为生物膜感染治疗提供新思路，强调了考虑生物膜特性和优化抗生素浓度的重要性。

　　### 研究背景
生物膜可增强细菌致病性，引发多种严重感染，在慢性和复发性感染中占比高达 80%。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）作为主要的生物膜形成病原体，被美国疾病控制与预防中心列为严重威胁。其形成的由胞外聚合物（EPS）构成的抗生素耐药生物膜，包含胞外 DNA（eDNA）、蛋白质和多糖等成分，增加了微生物根除的难度。

传统的抗生素最低抑菌浓度（MIC）检测仅评估浮游细菌生长，无法反映生物膜的存在、强度和生长阶段，这给感染治疗带来挑战。为解决这一问题，研究人员开展了此项研究，旨在明确 MRSA 生物膜在体外的生长阶段时间范围，通过 ζ 电位测量深入了解各阶段发展特征，并探究不同抗生素对后期生物膜的影响，评估抗生素浓度增加的疗效。

材料与方法

1. 细菌分离株：选取 115 株具有不同生物膜形成能力的葡萄球菌分离株，包括 23 种独特的 spa 类型，这些菌株来自罗德岛普罗维登斯退伍军人事务医疗中心 10 年间收集的样本。同时选用野生型、强生物膜形成的表皮葡萄球菌（ATCC 35984）、其等基因积累阴性突变株 M7 和强生物膜形成的甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（ATCC 35556）作为标准对照。
2. 抗菌药物：实验使用万古霉素、左氧氟沙星和达托霉素三种抗生素，由于在阳离子调节的 Mueller - Hinton 肉汤（CA - MHB）中的溶解度限制，最大测试浓度为 1,024 μg/mL。
3. 药敏试验：采用 CA - MHB 培养基，添加特定浓度的镁和钙（达托霉素测试时使用更高浓度钙），按照临床和实验室标准协会（CLSI）标准测定 MIC，重复两次。
4. 生物膜定量：运用改良的 Christensen 等人方法，将菌株从 - 80°C 储存的初始培养物中复苏，在胰蛋白胨大豆琼脂上划线培养 18 - 24 h 后，制备成 5 - 6 log₁₀ CFU/mL 的标准接种物，加入含特定成分的胰蛋白胨大豆肉汤（STSB），在 96 孔聚苯乙烯组织培养板中培养。经过孵育、去除浮游细菌、固定、染色、洗脱等步骤后，使用 BioTek 分光光度计在 570 nm 波长处测定光密度（OD₅₇₀），以此量化生物膜产量。
5. 生物膜阶段定义：生物膜第一阶段从 0 h 开始，以起始接种物代表典型感染生物负荷的浮游细胞，后续通过分析不同时间点的差异确定其他阶段。
6. ζ 电位测量：选取 11 株葡萄球菌分离株，在组织培养处理的平板中使用相同的 STSB 培养基培养形成第一和第四阶段生物膜，利用 Malvern Zetasizer Nano ZS 在无抗生素条件下测量 ζ 电位，通过 Smoluchowski 方程计算，每个样本重复测量 5 次。
7. 残留生物膜和活力测定：使用刃天青和结晶紫染色技术，测定三种抗生素对预形成的第四阶段（24 h）生物膜的影响。生物膜培养 24 h 后，加入含系列稀释抗生素的 STSB 培养 24 h，之后进行活力和残留生物量检测，计算生物膜活力并确定基于荧光测定的最低生物膜根除浓度（MBEC）。
8. 统计分析：运用方差分析（ANOVA）和事后 Tukey 检验，比较不同时间点以分类生物膜生长阶段，并确定抗生素处理对生物膜的影响显著性。以 α = 0.05 作为显著性标准，根据预先定义的结晶紫 OD 值区分弱（OD <1.0）和强（OD> 2.0）生物膜形成菌。

研究结果

1. 生物膜阶段定义：确定了生物膜发展的四个显著不同阶段。第一阶段从 0 h 到 6 h，为初始附着阶段；第二阶段从 6 h 到 16 h，此阶段生物膜稳定并开始形成 EPS 基质和微菌落；第三阶段从 16 h 到 24 h，是生物膜的成熟期；第四阶段从 24 h 开始，代表完全成熟的生物膜。
2. ζ 电位：强生物膜形成菌在浮游状态和第四阶段生物膜之间的 ζ 电位平均差异大于弱生物膜形成菌。在所有时间点，弱生物膜形成菌的平均 ζ 电位显著更负。强生物膜形成菌的 ζ 电位随生物膜阶段进展呈更负的趋势，而弱生物膜形成菌则不同，其第四阶段生物膜比第一阶段后期带更多正电荷。
3. 生物膜活力测定：万古霉素对弱生物膜形成菌的活力降低未达到 50% 或 75% 的阈值，对强生物膜形成菌部分菌株能实现至少 50% 的活力降低。左氧氟沙星仅在少数菌株中能使 50% 的细胞失去活力。达托霉素对所有菌株都能实现至少 50% 的非活力细胞，在较高浓度下（32 - 256 μg/mL，64 - 512× MIC）可使所有菌株的非活力细胞达到 75%。
4. 残留生物膜测定：万古霉素处理后，部分菌株残留生物量显著降低，但在高浓度下又增加；左氧氟沙星对强生物膜形成菌的残留生物量无显著影响，对部分弱生物膜形成菌反而增加；达托霉素处理后，所有菌株残留生物量显著降低，但有一株弱生物膜形成菌在高浓度下出现轻微的生物膜附着增加。

讨论

本研究使用成本效益高的体外微量滴定板生物膜检测方法，确定了 MRSA 生物膜生长阶段的时间点，为其他研究人员运用该方法提供了参考。与以往研究相比，虽在阶段划分上存在差异，但总体趋势相符。

通过 ζ 电位测量发现，弱生物膜形成菌初始附着时负电荷更高，强生物膜形成菌初始负电荷较低且随时间增加，这表明 ζ 电位可能与生物膜形成能力相关。

在抗生素疗效方面，达托霉素在降低生物膜活力和残留生物量上表现最佳，万古霉素和左氧氟沙星效果相对较差。同时研究还发现，抗生素浓度与生物膜反应存在复杂关系，高浓度抗生素不一定能更好地消除生物膜，可能存在最佳治疗浓度窗口。

研究存在一定局限性，如微量滴定板生物膜检测无法实时连续监测，使用表皮葡萄球菌作为对照不能完全代表金黄色葡萄球菌，96 孔板实验可能存在营养和空间限制，且样本中弱生物膜形成菌占比较大等。

结论

研究利用 115 株独特的 MRSA 分离株，确定了生物膜生长的四个阶段。观察到弱、强生物膜形成菌在初始附着时 ζ 电位的差异趋势。达托霉素在根除第四阶段成熟生物膜方面效果显著，相比万古霉素和左氧氟沙星，能使所有测试菌株的活力降低≥75%，并显著减少残留生物膜。不过，对于高浓度抗生素导致第四阶段生物膜生物量增加的机制，仍需进一步研究。