鉴定新型 amrR 缺失为临床类鼻疽伯克霍尔德菌分离株对美罗培南耐药的机制：为类鼻疽治疗带来新曙光

《Microbiology Spectrum 3.7》：Identification of novel amrR deletions as meropenem resistance mechanisms in clinical Burkholderia pseudomallei isolates

本文聚焦类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei），研究发现该菌临床分离株中 amrR 基因的新型部分缺失与美罗培南（MEM）耐药相关。通过构建突变株及实验验证，揭示其耐药机制，为类鼻疽治疗和防控提供关键依据，对提升治疗策略意义重大。

　　### 引言
类鼻疽是一种由类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei）引起的热带疾病，主要通过接种、摄入和吸入传播，在东南亚和澳大利亚北部流行，全球每年约有 165,000 例病例和 89,000 例死亡。该菌对多种抗生素具有固有耐药性，治疗需采用双相疗法，即便如此，泰国的死亡率仍高达 25%-40%。

类鼻疽伯克霍尔德菌的耐药机制包括酶失活、靶位点改变和外排泵机制等。其中，部分菌株对美罗培南和复方新诺明（SXT）耐药与外排泵有关。研究发现，AmrAB-OprA 外排泵属于耐药结节分化（RND）外排泵，由膜融合蛋白（MFP）、RND 转运蛋白和外膜蛋白（OMP）组成，分别由amrA（BPSL1804）、amrB（BPSL1803）和oprA（BPSL1802）编码，其调节基因amrR（BPSL1805）位于amrAB-oprA操纵子上游。

此前研究分析了 1,317 株泰国东北部患者的临床类鼻疽伯克霍尔德菌分离株全基因组，鉴定出 3 株美罗培南低敏感（MEM-LS）菌株（DR10212A、DR90049A 和 DR90031E），它们存在amrR基因的部分缺失突变。本研究旨在通过诱变和定量逆转录实时聚合酶链反应（RT-qPCR），探究这些突变在降低美罗培南敏感性中的作用。

材料和方法

1. 生物安全批准：本研究获得了玛希隆大学热带医学学院机构生物安全委员会的批准（MU 2022–031）。
2. 类鼻疽伯克霍尔德菌分离株：从泰国东北部九家医院 2015 年 7 月至 2018 年 12 月收集的 1,317 株临床分离株中，选取 3 株 MEM-LS 菌株（DR10212A、DR90049A 和 DR90031E）。通过 Ashdown 琼脂上的典型菌落形态、乳胶凝集试验、基于 TTS1 的 RT-PCR 和全基因组测序鉴定为类鼻疽伯克霍尔德菌，所有菌株在玛希隆大学热带医学学院生物安全 3 级（BSL-3）实验室培养。
3. 抗生素敏感性测定：采用肉汤微量稀释法（BMD）测定阿莫西林克拉维酸（AMC）、头孢他啶（CAZ）、美罗培南和 SXT 对类鼻疽伯克霍尔德菌分离株的最低抑菌浓度（MIC）。根据临床和实验室标准协会（CLSI）指南准备抗生素浓度范围，按照欧盟药敏试验委员会（EUCAST）标准判断美罗培南敏感性，MIC > 2 μg/mL 为 MEM-LS 菌株。
4. amrR 突变株和互补菌株的构建：利用 pEXKm5 质粒替换法，将参考菌株 K96243 的amrR基因序列（K96243-amrR）导入 DR10212A、DR90049A 和 DR90031E 菌株中，构建互补菌株。通过 PCR、Sanger 测序和全基因组测序验证互补菌株的正确性，并比较亲本菌株和互补菌株对 AMC、CAZ、美罗培南和 SXT 的抗生素敏感性。
5. DNA 提取和 Sanger 测序：使用 QIAamp DNA Mini Kit 提取类鼻疽伯克霍尔德菌过夜培养物的基因组 DNA，用 NanoDrop Lite 分光光度计测定浓度，琼脂糖凝胶电泳评估质量。用设计的引物对互补菌株的amrR插入序列进行 Sanger 测序。
6. 全基因组测序和分析：对三对亲本和互补菌株进行全基因组测序（WGS），验证互补菌株的正确性。提取 DNA 后，进行 150 碱基读长文库制备，用 Illumina Hiseq2000 系统测序。使用 Velvet v.1.2.10 进行从头组装，CheckM v.1.2.2 评估基因组完整性和污染，QUAST v.5.0.2 评估 contigs 数量和 N50，Snippy v.4.6 确定基因组变异。
7. RNA 提取和转录本定量：将类鼻疽伯克霍尔德菌在 LB 肉汤中富集培养，再培养至对数中期，用 TRIzol 试剂提取 RNA，经 RNase-Free DNase 处理后测定浓度。采用两步 RT-qPCR 评估oprA、amrB和amrA基因的表达水平，以 16S rRNA 为内参基因，用 2^-ΔCT方法计算基因表达水平，通过 Student’s t 检验比较 MEM-LS 亲本菌株和相应 MEM 敏感突变株的表达差异，P < 0.05 为有统计学意义。

结果

1. 用野生型 K96243 amrR 片段互补 MEM-LS 分离株：与参考菌株 K96243 相比，DR10212A、DR90049A 和 DR90031E 菌株的amrR基因分别存在 V197del、A202_R207del 和 H92_S154del 突变。通过等位基因置换诱变，成功将 K96243-amrR片段插入三株 MEM-LS 菌株，构建了互补突变株。PCR 和测序结果证实了互补菌株构建成功。
2. K96243-amrR 互补突变株对美罗培南更敏感：测定互补菌株的美罗培南 MIC 并与亲本菌株比较，发现 DR90049A∷K96243-amrR和 DR90031E∷K96243-amrR的美罗培南 MIC 从 4 μg/mL 降至 1 μg/mL，变为美罗培南敏感菌株；DR10212A∷K96243-amrR的美罗培南 MIC 从 16 μg/mL 降至 4 μg/mL，但仍为 MEM-LS 菌株。互补菌株对 AMC、CAZ 和 SXT 的 MIC 无显著变化，表明amrR区域的缺失突变可能是 MEM-LS 表型的潜在原因。
3. amrR 部分缺失增强 amrAB-oprA 外排泵基因的转录：检测亲本菌株和互补菌株中oprA、amrB和amrA基因的表达水平，发现互补菌株中这些基因的表达均显著下调。例如，互补菌株中oprA基因表达至少降低 5 倍，amrB基因降低 10 倍，amrA基因降低 11 倍，说明amrR基因的特定突变导致amrAB-oprA外排泵转录水平上调，与美罗培南耐药相关。

讨论

本研究通过诱变、MIC 测试和 RT-qPCR 证实，类鼻疽伯克霍尔德菌临床分离株中amrR基因的部分缺失与amrAB-oprA外排泵基因上调和美罗培南耐药有关。RND 操纵子在amrR调控下形成的复合物能将抗菌化合物泵出细菌细胞。部分 MEM-LS 菌株互补后美罗培南 MIC 变化，表明amrR基因改变影响美罗培南敏感性，但 DR10212A∷K96243-amrR仍为 MEM-LS 菌株，可能存在其他耐药因素，如penA突变。

此前报道澳大利亚分离株中amrR的多种突变可导致美罗培南耐药，本研究菌株中未发现这些突变，说明不同地区amrR基因突变位点不同，但都可能是美罗培南耐药的潜在因素。本研究还发现，DR10212A 对 CAZ 耐药与penA基因的 P167S 突变有关，SXT 耐药机制可能与amrR无关，需进一步研究。

此外，临床类鼻疽伯克霍尔德菌美罗培南耐药的进化机制尚不清楚，可能与抗生素治疗期间暴露于亚最佳或短期抗生素有关。部分患者反复感染，其分离株美罗培南敏感性发生变化，提示长期抗生素暴露可能导致美罗培南耐药。类鼻疽伯克霍尔德菌在宿主内的持续存在和突变会导致复发感染、增强毒力和产生耐药性。本研究揭示了美罗培南耐药的遗传机制，强调了长期监测临床分离株和预防复发感染的重要性，为改进类鼻疽的诊断、治疗和公共卫生策略提供了基础。但amrR基因缺失影响amrAB-oprA外排泵表达的分子机制仍需进一步验证，如功能测定或相互作用研究等。