潜伏感染小鼠鼻相关淋巴组织（NALT）藏 HSV-1 DNA，地塞米松可激活病毒复制，揭示感染新机制

《Journal of Virology 4.0》：Murine nasal-associated lymphoid tissue (NALT) harbors human alphaherpesvirus 1 (HSV-1) DNA during latency, and dexamethasone triggers viral replication

这篇研究发现，潜伏感染小鼠的鼻相关淋巴组织（NALT）中存在人类 α 疱疹病毒 1（HSV-1）DNA，地塞米松（DEX）能诱导其复制。研究还确定了携带病毒 DNA 的细胞类型，为 HSV-1 相关疾病研究提供新视角，值得关注。

　　

研究背景

人类 α 疱疹病毒 1（HSV-1）急性感染会引发多种疾病，如结膜炎、脑炎、生殖器病变和疱疹性食管炎（herpes esophagitis，HE） 等。感染后，HSV-1 会在三叉神经节和中枢神经系统的神经元中建立终身潜伏。

值得注意的是，某些动物 α 疱疹病毒亚科成员，像牛 α 疱疹病毒 1（BoHV-1）、犬疱疹病毒 1、马疱疹病毒 4 和伪狂犬病病毒，能在扁桃体中建立静止 / 潜伏感染。BoHV-1 在小牛潜伏期重新激活时，会出现病毒基因表达和从扁桃体排出病毒的现象。

由于啮齿动物的鼻相关淋巴组织（nasopharynx-associated lymphoid tissue，NALT）在结构和功能上与人类和其他哺乳动物的扁桃体相似，本研究旨在探究 NALT 是否是 HSV-1 的潜伏感染位点，以及地塞米松（dexamethasone，DEX）对其病毒复制的影响。

实验方法

1. 病毒和细胞培养：使用 Vero 猴肾细胞和 Neuro-2A 细胞培养 HSV-1 菌株 McKrae，在特定培养基中培养细胞并维持环境条件。
2. 动物实验：选用 6 - 8 周龄的 C57BL/6 J 小鼠，适应环境后，经眼部感染 10⁵ PFU/mL 的 HSV-1 菌株 McKrae。在感染后的不同时间点采集口腔拭子检测病毒。30 天后，认定小鼠进入潜伏感染期，获取 NALT 进行后续实验。
3. 核酸检测：采用逆转录和定量 PCR（RT/qPCR）技术，检测 NALT 中病毒 DNA 和 RNA 的表达。实验过程包括样本处理、核酸提取、引物设计以及 PCR 反应等步骤，以分析病毒相关基因的表达情况。
4. 细胞分选与检测：利用荧光激活细胞分选（fluorescence-activated cell sorting，FACS）技术，对 NALT 中的细胞进行分类。分选后的细胞分别培养在含或不含 DEX 的培养基中，检测病毒 DNA、RNA 表达以及感染性病毒的产生。同时，通过免疫细胞化学方法检测神经元标记 NeuN，以排除神经元污染。

实验结果

1. HSV-1 在潜伏感染小鼠 NALT 中的检测：眼部感染 HSV-1 后，在感染初期，小鼠口腔拭子中可检测到低水平的感染性 HSV-1 病毒，但 5 天后则检测不到。潜伏感染 30 天后，NALT 中虽未检测到感染性病毒，但存在病毒 DNA。与在 PBS 中培养的 NALT 相比，在含 DEX 的培养基中培养 48 小时的 NALT，其 HSV-1 DNA 水平显著升高。
2. 感染性 HSV-1 的检测：将潜伏感染小鼠的 NALT 在含 DEX 的 MEM 中培养，3 天后可检测到感染性病毒，且在后续时间点持续存在，而在不含 DEX 的培养基中则未检测到。
3. HSV-1 基因表达分析：在潜伏感染小鼠的 NALT 中，未检测到潜伏期相关转录本（latency-associated transcript，LAT）。但当 NALT 在含 DEX 的培养基中培养时，关键的立即早期病毒转录调节因子 ICP0 和 ICP4 的 RNA 表达显著增加，同时糖蛋白 B（glycoprotein B，gB）RNA 表达也随时间增加。
4. ICP0 和 ICP4 蛋白表达检测：对 NALT 单细胞悬液进行培养和染色，结果显示在含 DEX 的培养基中培养 48 小时后，ICP0 和 ICP4 蛋白主要定位于细胞核。而在不含 DEX 的培养基中培养时，未检测到这两种蛋白的表达。
5. NALT 细胞亚型分析：通过 FACS 技术对 NALT 细胞进行分选，确定了 B 细胞、T 细胞、树突状细胞（dendritic cells，DCs）、微褶细胞（microfold cells，M 细胞）和自然杀伤细胞（natural killer cells，NK 细胞）等细胞亚型的比例。结果表明，DCs、M 细胞和 NK 细胞在 NALT 中的比例相对较小。
6. 携带 HSV-1 DNA 的 NALT 细胞鉴定：分选后的细胞在含 DEX 的培养基中培养 24 小时后，发现 NK 细胞、M 细胞和 DCs 中 HSV-1 gB DNA 水平显著升高，同时 ICP0 和 ICP4 RNA 表达也显著增加。而 B 细胞和 T 细胞中，无论是否使用 DEX 处理，均未检测到病毒 DNA 和相关 RNA 表达。
7. 感染性病毒产生检测：将分选后的细胞在含 DEX 的培养基中培养后，DCs、M 细胞和 NK 细胞可产生感染性病毒，而 B 细胞和 T 细胞则不能。
8. 神经元污染检测：通过免疫细胞化学和 RT-qPCR 检测，证实分选的 NALT 细胞未受到神经元污染。

研究结论

本研究表明，HSV-1 可在小鼠眼部感染后在 NALT 中建立静止 / 潜伏感染。DEX 处理能够触发病毒基因表达、复制和感染性病毒的产生。DCs、NK 细胞和 M 细胞是 NALT 中携带 HSV-1 DNA 的主要细胞类型，在 DEX 处理后可产生感染性病毒。

尽管神经元是 HSV-1 潜伏的主要位点，但本研究揭示了 NALT 在病毒潜伏和激活中的重要作用，为进一步研究 HSV-1 感染机制提供了新的方向。未来研究可聚焦于确定维持 NALT 细胞与 TG 神经元中潜伏 / 静止感染的细胞因子差异，以及 HSV-1 在人类扁桃体中是否也能建立类似的潜伏感染。