非洲猪瘟病毒 I177L 蛋白：炎症反应 “开关” 与防控新靶点

《Journal of Virology 4.0》：African swine fever virus I177L induces host inflammatory responses by facilitating the TRAF6-TAK1 axis and NLRP3 inflammasome assembly

这篇研究发现非洲猪瘟病毒（ASFV）的 I177L 蛋白通过激活 TRAF6-TAK1 轴和 NLRP3 炎性小体，引发宿主炎症反应。该成果首次揭示 ASFV 炎症机制，为降低 ASF 死亡率、研发小分子药物和疫苗提供关键理论支撑。

　　### 非洲猪瘟病毒 I177L 诱导宿主炎症反应的机制研究
非洲猪瘟（African swine fever，ASF）是一种对猪具有高度传染性的病毒性疾病，由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）引起，其致死率极高，可接近 100%。由于目前缺乏有效的疫苗和治疗方法，ASF 给养猪业带来了巨大的经济损失。在 ASFV 感染过程中，过度的炎症反应是导致猪死亡的主要原因，但其中涉及的病毒蛋白及具体机制尚不明确。本研究聚焦于 ASFV 的 I177L 蛋白，深入探究其在炎症反应中的作用及机制，为 ASF 的防控提供了重要的理论依据。

ASFV I177L 是主要促炎蛋白

研究人员用 ASFV（ASFV CN/GS/2018）感染猪骨髓来源的巨噬细胞（porcine bone marrow-derived macrophages，BMDMs），发现 ASFV 感染能以时间和剂量依赖的方式诱导 BMDMs 中 IL-1β 和 TNFα 的 mRNA 表达以及 IL-1β 的分泌，同时激活细胞上清液中 IL-1β 的成熟（p17）和 Caspase-1 的切割（p20），以及细胞裂解物中 pro-IL-1β 的产生。相反，抑制 ASFV 复制或蛋白表达则会减轻这些炎症反应，表明活跃的 ASFV 感染、复制和蛋白表达在引发炎症中起关键作用。

为了找出 ASFV 中促进炎症激活的蛋白，研究人员构建了一系列单基因缺失的重组 ASFV，并与亲本 ASFV 进行比较。通过基因分型 PCR 确定目标基因成功缺失，筛选实验结果显示，与亲本 ASFV 感染组相比，ASFV-ΔI177L 感染细胞中 IL-1β 和 TNF-α 的 mRNA 表达、IL-1β 的成熟（p17）以及 Caspase-1 的切割（p20）水平最低，证明了 I177L 在 ASFV 介导的炎症反应中具有关键作用。

I177L 缺失显著减弱 ASFV 诱导的炎症激活和 IL-1β 产生

为了进一步研究 I177L 对 ASFV 诱导炎症的影响，研究人员构建了重组病毒 ASFV-CN/GS/2018-I177LGFP（ASFV-I177L^G），使 I177L 基因与 GFP 序列融合表达融合蛋白，便于观察 I177L 的表达。比较 ASFV-I177L^G和 ASFV-ΔI177L 感染 BMDMs 后的炎症反应，发现 ASFV-I177L^G能激活 IL-1β 和 TNFα 的 mRNA 表达，诱导大量成熟 IL-1β 分泌，显著激活 IL-1β 成熟（p17）和 Caspase-1 切割（p20），而 ASFV-ΔI177L 的这些作用则明显减弱。高剂量感染实验也证实，I177L 在 ASFV 诱导的炎症和 IL-1β 产生中起重要作用。

I177L 通过增强 TRAF6-TAK1 复合物的形成促进 NF-κB 信号通路

炎症反应通常包括 NF-κB 启动阶段（信号 1）和炎性小体激活阶段（信号 2）。研究发现，ASFV 感染会增加磷酸化 IκBα（p-IκBα）和磷酸化 p65（p-p65）的水平，NF-κB 抑制剂 BAY-11–7082 可显著抑制 ASFV 和 LPS 触发的 IL-1β mRNA 表达和 IL-1β 分泌，表明 NF-κB 信号通路在 ASFV 介导的炎症中被激活。

进一步研究发现，I177L 能剂量依赖性地增强 IL-1β 触发的 NF-κB 报告基因活性，ASFV-I177L^G感染的猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophages，PAMs）中 p-IκBα 和 p-p65 水平高于 ASFV-ΔI177L 感染组。通过免疫共沉淀实验证实，I177L 可与 TRAF6 和 TAK1 相互作用，且不影响它们的表达。在细胞中，I177L 能增强 TRAF6 与 TAK1 的结合，促进 TRAF6-TAK1 复合物的组装，从而刺激 NF-κB 信号通路的激活。

TRAF6 自泛素化对 I177L 介导的 TRAF6-TAK1 复合物组装至关重要

TRAF6 的自泛素化有助于其激活，研究人员发现 I177L 能增加 TRAF6 的自泛素化，催化 TRAF6 与野生型泛素和泛素 - K63 的泛素化，但不与泛素 - K48 作用。在 ASFV-I177L^G感染组中，TRAF6 的泛素化水平显著升高，TAK1 更易被招募和激活。而当 TRAF6 被替换为缺乏 E3 连接酶活性的 TRAF6 (C70A) 突变体时，I177L 对 TRAF6 泛素化的激活作用受到抑制，TRAF6 (C70A) 与 TAK1 的相互作用以及 I177L 对该相互作用的增强作用均减弱，表明 I177L 通过促进 TRAF6 的 K63 - 泛素化来增强 TRAF6-TAK1 的结合。

I177L 依赖 TRAF6 的 E3 连接酶活性激活 TAK1/IκBα/p65 轴

TAK1 的泛素化有助于其磷酸化并激活下游分子。研究发现，ASFV 感染会增强 PAMs 中 TAK1 的泛素化和磷酸化，抑制 TRAF6 表达会降低这种现象，且 TRAF6 而非 TRAF6 (C70A) 能增强 HEK293T 细胞中 TAK1 的泛素化，表明 TRAF6 的 E3 泛素连接酶活性对 TAK1 激活至关重要。

在 ASFV-I177L^G感染的 PAMs 中，TAK1 的泛素化和磷酸化水平高于 ASFV-ΔI177L 感染组，说明 I177L 能增强 TAK1 的激活。在 HEK293T 细胞中，I177L 和 TRAF6 共同作用可进一步增强 TAK1 的泛素化，而 TRAF6 (C70A) 则失去这种能力。此外，I177L 激活的 TAK1 可通过激活 IκBα 和 p65，进而激活 NF-κB 信号通路。使用 TAK1 抑制剂 (5Z)?7-Oxozeaenol（(5Z)?7O）处理细胞，可显著降低 TAK1、IκBα 和 p65 的磷酸化水平，减少 pro-IL-1β 表达、IL-1β 成熟和 Caspase-1 切割，同时抑制 ASFV 的复制，表明 TAK1 在 ASFV 介导的 NF-κB 信号通路和炎症中起重要作用。

I177L 促进 NLRP3 炎性小体激活

炎性小体在刺激或病毒诱导的炎症反应中可诱导 IL-1β 的产生和分泌，其中 NLRP3 炎性小体研究最多。研究发现，干扰 PAMs 中 NLRP3、ASC 或 Caspase-1 的表达，会减弱 ASFV 触发的 IL-1β 成熟和 Caspase-1 切割，表明 NLRP3 对 ASFV 介导的炎症反应至关重要，ASFV 通过激活 NLRP3 炎性小体诱导炎症。

在 HEK293T 细胞中构建 “NLRP3 炎性小体”，发现 I177L 存在时，IL-1β 的成熟（p17）和 Caspase-1 的切割显著增加。在 ATP 刺激的 PAMs 中，ASFV-I177L^G感染组的 p17 和 p20 水平高于 ASFV-ΔI177L 感染组。此外，ASFV-I177L^G感染的 PAMs 和过表达 GFP-I177L 质粒的 LPS 刺激的 PK15 细胞中，NLRP3 和 pro-IL-1β 的表达增加。通过免疫共沉淀实验证实，I177L 可与 NLRP3 和 ASC 相互作用，激活 NLRP3 炎性小体。

I177L 促进 NLRP3 炎性小体组装

NLRP3 与 ASC 结合形成活性炎性小体复合物。研究发现，I177L 会抑制 ASC 的表达，但能增强 NLRP3 与 ASC 的基础相互作用。在细胞中，I177L 存在时，NLRP3、ASC 和 I177L 会共定位形成更大的斑点结构，促进 ASC 寡聚化，激活 NLRP3 炎性小体。

I177L 缺失减轻猪体内 ASFV 介导的炎症反应

在动物实验中，将猪分为两组，分别肌肉注射 ASFV 或 ASFV-ΔI177L 重组病毒。结果显示，注射 ASFV 的猪在接种后 7 天内死亡或因持续高热安乐死，而注射 ASFV-ΔI177L 的猪大多存活，仅 1 头出现短暂高热。ASFV-ΔI177L 注射组猪血清中 IL-1β 和 TNF-α 水平降低，器官病变减轻，病毒载量较低，且能产生更多 ASFV 特异性 p30 抗体，对 ASFV 攻击具有保护作用，表明 I177L 缺失可减轻 ASFV 引发的严重炎症反应，ASFV-ΔI177L 疫苗可免疫猪抵抗 ASFV 攻击。

讨论

ASF 可分为五种临床形式，强毒力的 II 型田间毒株常引起急性感染，死亡率高，感染后会出现高热、血管渗漏、心肌病、肺损伤以及促炎细胞因子的过度释放等症状。本研究揭示了 ASFV 激活炎症反应的重要机制，即 I177L 通过增强 TRAF6 的自泛素化，促进 TRAF6-TAK1 复合物的形成，激活 TAK1，进而激活 NF-κB 信号通路，增加 NLRP3 和 pro-IL-1β 的表达。同时，I177L 促进 NLRP3 与 ASC 的结合和 ASC 寡聚化，激活 NLRP3 炎性小体，导致成熟 IL-1β 的产生，引发炎症反应。

TAK1 在 ASFV 激活的 NF-κB 信号通路和炎症中起关键作用，其抑制剂 (5Z)-7-oxozeaenol 可有效抑制 ASFV 诱导的炎症和病毒复制，是缓解 ASFV 介导炎症的潜在治疗靶点。此外，ASFV 中存在多种对 NF-κB 信号通路和 NLRP3 炎性小体具有相反调节作用的蛋白，I177L 与这些蛋白的相互作用及机制有待进一步研究。

虽然本研究取得了重要进展，但仍有改进空间，如增加重组病毒筛选可发现更多促炎 ASFV 蛋白，且可能存在其他机制参与 ASFV 介导的炎症反应。不过，该研究首次明确了 ASFV 诱导炎症的关键机制，为控制 ASF、研发小分子药物和疫苗提供了重要的理论基础。