猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）致鸡隐性感染机制揭示：激活 Wnt/β-catenin 通路提升鸡体抗性

《Journal of Virology 4.0》：Abortive PDCoV infection triggers Wnt/β-catenin pathway activation, enhancing intestinal stem cell self-renewal and promoting chicken resistance

本文聚焦猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）。研究发现，PDCoV 感染鸡肠道类器官单层细胞后呈顿挫感染，不产生子代病毒。感染激活 Wnt/β-catenin 通路，促进肠道干细胞（ISCs）自我更新，增强鸡对 PDCoV 的抵抗力，为家禽业防控 PDCoV 提供新视角。

　　### 引言
冠状病毒（CoVs）包含四个属，宿主范围广泛。猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）属于 δ 冠状病毒属，是能感染哺乳动物的唯一该属病毒，其天然宿主主要为鸟类。PDCoV 于 2012 年在香港猪粪便中首次被发现，随后在全球多地传播，给养猪业造成重大经济损失。它可感染猪、鸟类、人类等多种宿主，但跨物种传播机制尚不明确。

PDCoV 主要感染猪小肠上皮细胞，引发急性水样腹泻、呕吐和脱水等症状，仔猪死亡率较高。肠道上皮作为宿主与肠道微环境的物理屏障，其完整性和稳态由肠道干细胞（ISCs）驱动的持续更新维持。ISCs 可分化为多种细胞，完成上皮更新。Wnt/β-catenin 信号通路在 ISCs 的自我更新和分化中发挥关键作用，激活该通路可加速 ISCs 重新填充，促进肠道上皮再生。此前研究表明，该通路的调节对病毒感染、上皮再生和感染后修复至关重要，但 PDCoV 感染时的相关情况尚未研究。本研究以猪为阳性对照，探究鸡对 PDCoV 感染的易感性，以及感染对鸡肠道相关指标和 Wnt/β-catenin 通路的影响。

结果

1. 鸡和猪肠道类器官及类器官单层的分离与比较：分别从 18 日龄鸡胚肠道组织和新生仔猪空肠组织分离出肠道隐窝，并培养成肠道类器官。鸡源肠道类器官形成较大的三维结构，芽体较多；猪源肠道类器官芽体较少且细长。免疫荧光染色显示，两者均含有 Lgr5⁺肠道干细胞和多种分化的上皮细胞。将三维肠道类器官解离成单细胞，培养 4 天后形成融合的肠道类器官单层，成功建立了鸡和猪肠道类器官及类器官单层模型。
2. 鸡肠道类器官单层易受 PDCoV 感染，但不产生子代病毒：用 PDCoV 感染鸡和猪肠道类器官单层 1 小时和 24 小时，免疫荧光检测发现两者均有 PDCoV-N 阳性信号，猪细胞阳性比例更高，且猪肠道类器官单层出现明显细胞病变效应，鸡的则无。实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）结果显示，鸡肠道类器官单层感染 1 小时时，PDCoV-N mRNA 水平和阳性细胞数较高，随后下降；猪肠道类器官单层中病毒复制效率更高，mRNA 水平随时间上升。空斑试验表明，仅在猪肠道类器官单层培养上清中检测到有活力的病毒。感染后，猪肠道类器官单层中干扰素（IFN-β、IFN-λ）、干扰素刺激基因（MX1、OASL）和促炎因子（IL6、TNF-α）的转录显著诱导，而鸡肠道类器官单层中除 IFN-λ 显著下降外，其他基因无明显变化。这表明鸡肠道类器官单层可被 PDCoV 感染，但不支持病毒复制和产生子代病毒。
3. PDCoV 感染破坏猪肠道类器官单层的肠道屏障，对鸡的影响较小：RT-qPCR 检测发现，PDCoV 感染后，猪肠道类器官单层中杯状细胞分泌的黏蛋白（MUC2）和紧密连接蛋白（ZO-1、occludin、claudin-1）的 mRNA 水平显著下降；鸡肠道类器官单层中 MUC2 水平显著升高，claudin-1 显著下降，ZO-1 和 occludin 水平无明显变化。测量跨上皮电阻（TEER）发现，鸡和猪肠道类器官单层均可形成完整屏障，但 PDCoV 感染后，猪肠道类器官单层的 TEER 下降幅度（40%）大于鸡（20%）。共培养实验中，与感染 PDCoV 的猪肠道类器官单层共培养的 ST 细胞出现细胞病变效应且检测到病毒转录本，而与鸡肠道类器官单层共培养的 ST 细胞无异常。说明 PDCoV 感染对鸡肠道类器官单层屏障完整性的破坏程度远低于猪。
4. PDCoV 感染激活鸡肠道类器官单层的 Wnt/β-catenin 信号通路：鉴于 ISCs 在肠道上皮更新和再生中的关键作用，以及 Wnt/β-catenin 信号通路对 ISCs 增殖和分化的重要性，推测 PDCoV 感染激活该通路是鸡肠道屏障受影响小的原因。RT-qPCR 检测发现，PDCoV 感染鸡肠道类器官单层后，Wnt/β-catenin 通路相关基因（Wnt3a、Lrp5、β-catenin、TCF4）和 Wnt 靶基因（Lgr5、cyclin D1、c-myc）显著上调，TA 细胞标记基因 PCNA、ISCs 标记基因 BMI1 和潘氏细胞标记基因 Lyz 的 mRNA 水平也显著上调。在猪肠道类器官单层中，部分基因有不同变化。免疫荧光检测显示，PDCoV 感染使鸡和猪肠道类器官单层中 EdU 阳性的 ISCs 数量增加，鸡的比例更高。表明 PDCoV 感染激活了鸡肠道类器官单层的 Wnt/β-catenin 信号通路，促进了肠道干细胞的自我更新和增殖，有助于肠道上皮损伤后的更新和再生。
5. PDCoV 在鸡体内无法建立有效感染：进行鸡和仔猪的 PDCoV 攻毒对比实验，感染 48 小时后，仔猪出现严重水样腹泻和呕吐，而鸡无临床感染症状。剖检发现，仔猪有明显临床病变，鸡则无。H&E 染色显示，仔猪空肠和回肠组织绒毛高度显著缩短，鸡小肠组织无组织病理学变化。RT-qPCR 检测发现，鸡小肠组织中未检测到 PDCoV 的病毒 RNA（vRNA），仔猪则有大量 PDCoV-M 和 N mRNA。免疫组化检测显示，鸡小肠中无 PDCoV-N 阳性信号，仔猪空肠上皮细胞胞质中有高水平信号。此外，感染仔猪空肠组织中干扰素、干扰素刺激基因和炎症因子的 mRNA 水平显著高于未感染仔猪，而鸡的这些基因水平未受影响，仅 TNF-α 受到抑制。说明 PDCoV 在鸡体内无法建立有效感染，也未触发抗病毒先天免疫反应。
6. PDCoV 感染通过 Wnt/β-catenin 通路促进鸡肠道干细胞的体内自我更新和增殖：对比 PDCoV 感染对鸡和猪空肠黏液层和紧密连接的影响，PAS 染色和免疫组化分析显示，感染鸡的杯状细胞数量和分泌的 MUC2 显著增加，感染仔猪则显著减少，RT-qPCR 检测结果与之相符。感染鸡空肠组织中紧密连接蛋白的 mRNA 水平无明显变化，感染仔猪的 ZO-1 和 claudin-1 显著下降。电镜观察发现，感染鸡的肠上皮细胞微绒毛完整整齐，感染仔猪的则严重受损脱落。表明 PDCoV 感染未破坏鸡的肠道物理屏障。

进一步研究发现，PDCoV 感染激活了鸡体内的 Wnt/β-catenin 通路，除 Lrp5 外，相关基因和 Wnt 靶基因显著上调。免疫组化染色显示，感染鸡空肠隐窝区域 c-myc 水平增加，PCNA（TA 细胞标记）、BMI1（ISCs 标记）和 Lyz（潘氏细胞标记）水平也显著增加。在感染猪的空肠中，部分基因有不同变化。说明 PDCoV 感染激活了鸡的 Wnt/β-catenin 通路，促进了肠道干细胞的自我更新和增殖，有助于感染后肠道上皮的更新和再生。
7. Wnt/β-catenin 信号通路促进 PDCoV 感染后肠道上皮的更新和再生：为探究 Wnt/β-catenin 通路激活是否有助于补充脱落的感染细胞和修复受损肠道屏障，用 Wnt/β-catenin 通路激活剂 BML284 和抑制剂 ICG001 处理猪肠道类器官单层。结果显示，BML284 处理使 β-catenin 积累，Wnt 靶基因、增殖相关基因和紧密连接相关基因表达增加，TEER 升高；ICG001 处理则相反。此外，BML284 处理可促进 PDCoV 感染下猪 ISCs 的更新，加速肠道上皮细胞的更新和补充；ICG001 处理则抑制相关过程。在鸡肠道类器官单层中，ICG001 处理减少 β-catenin 积累，PDCoV + ICG001 处理则促进 β-catenin 积累和相关基因表达。表明 Wnt/β-catenin 信号通路可促进肠道干细胞自我更新，加速上皮更新，补偿感染细胞的脱落，维持肠道屏障完整性，增强对 PDCoV 感染的抵抗力。

讨论

病毒在宿主细胞内的生命周期包括吸附、入侵、核酸释放与复制、核衣壳组装和成熟释放等步骤。PDCoV 起源于鸟类的罕见溢出事件，可感染哺乳动物，但在非自然宿主（如鸡）中通常仅引起轻微或无症状感染，其在禽类中的传播潜力和复制效率此前未得到充分研究。

本研究发现，PDCoV 可感染鸡肠道类器官单层，但无法复制，在猪肠道类器官单层中则能建立有效感染。鸡和仔猪的攻毒实验结果也显示，两者感染症状差异明显。造成这些差异的原因可能包括 PDCoV 对猪的宿主特异性更强、鸡的品种和 PDCoV 毒株差异，以及感染暴露时间、饮食、环境和微生物群等多种因素。PDCoV 感染鸡属于顿挫感染，即病毒无法完全劫持宿主细胞，不产生或产生极少量有感染性的病毒，也无明显细胞病变效应，但猪到鸡的成功传播潜力仍未知。

肠道屏障是抵御病原体的第一道防线，紧密连接和黏液层是其重要组成部分。PDCoV 感染破坏了猪的肠道屏障，导致紧密连接受损、杯状细胞数量和 MUC2 表达减少，引发腹泻；而在鸡中，感染增加了杯状细胞数量和 MUC2 表达，可能是鸡对 PDCoV 不敏感的原因之一。

Wnt/β-catenin 通路在 ISCs 的增殖和分化中不可或缺。此前研究表明，某些病原体感染可激活该通路，促进肠道上皮再生。本研究发现，PDCoV 感染仔猪激活了先天免疫、诱导了炎症因子表达并激活了 Wnt/β-catenin 通路，但产生的新细胞不足以应对感染损伤；而在鸡中，顿挫感染激活了 Wnt/β-catenin 通路，却未诱导先天免疫和炎症反应，ISCs 的更新和上皮再生足以修复 PDCoV 感染造成的有限损伤。

综上所述，PDCoV 具有在猪和鸡之间传播的潜力，但在鸡体内无法有效复制。顿挫感染保护了鸡的肠道物理屏障，激活了 Wnt/β-catenin 通路，促进了鸡 ISCs 的自我更新和分化，加速了上皮再生和肠道损伤修复。尽管鸡被认为是 PDCoV 的终末宿主，但不能排除 PDCoV 进化后在鸡群中高效感染和传播的可能性，因此对鸡群进行 PDCoV 的密切监测十分必要，以防止病毒溢出和疫情爆发。