A SecA 相关蛋白酶对金黄色葡萄球菌蛋白 A 表面展示调控机制的深度解析 —— 开拓细菌蛋白靶向新认知

《Journal of Bacteriology》：A SecA-associated protease modulates the extent of surface display of staphylococcal protein A

这篇研究聚焦于金黄色葡萄球菌（S. aureus），发现 PepV 蛋白酶可调节含 YSIRK/GXXS 基序前体蛋白的表面展示，影响葡萄球菌蛋白 A（SpA）定位。研究揭示了 PepV 与 SpA 前体的相互抑制关系，为理解细菌蛋白靶向机制提供了新视角，值得关注。

　　

研究背景

金黄色葡萄球菌表面约有 24 种蛋白，这些蛋白在细菌获取铁、黏附入侵宿主细胞、逃避免疫防御等过程中发挥关键作用。多数蛋白通过分选酶（sortase）共价结合到细胞壁（CW）上，它们具有 N 端信号肽用于分泌，C 端含 LPXTG 样基序等用于锚定。

葡萄球菌蛋白 A（SpA）等蛋白会通过将分泌的多肽直接整合到新合成的横壁上，分布在细菌表面。信号序列中保守的 YSIRK/GXXS 基序可引导前体蛋白定向到分裂横壁，而携带经典信号肽的表面蛋白则沉积在细胞极点。尽管表面蛋白在葡萄球菌和链球菌疾病中意义重大，但目前对其定位呈现的具体调控因素和机制，以及信号肽的作用，了解仍十分有限。

此前研究通过筛选热敏感（TS）突变体，发现了可能影响含 YSIRK/GXXS 基序蛋白产生、加工或靶向的因素，其中包括一个热敏感的 secA 等位基因和编码二肽酶 PepV 基因的突变。后续研究还发现 PepV 可能是 SecA 的配体，本研究在此基础上，深入探究 PepV 对 SpA 等蛋白表面展示的影响。

PepV 的基本特征

在金黄色葡萄球菌中，PepV 属于 M20 肽酶家族，此前研究发现其在体外可作为锰依赖的二肽酶，能切割青霉素等二肽底物。它具有 M20 家族金属蛋白酶的双结构域，包含一个常规催化结构域和一个可作为盖子或促进二聚化的结构域。

通过 InterPro 查询发现，在金黄色葡萄球菌的蛋白质组中，利用常规的 BLASTP 搜索无法识别出 PepV 样蛋白，但使用 IPR002933（M20 蛋白酶结构域）进行查询，可检索到 9 种相关蛋白。PepV 基因位于 sasC 基因附近，sasC 编码的细胞壁锚定蛋白带有 YSIRK/GXXS 信号肽，参与细胞间黏附和生物膜积累。同时，PepV 基因位于脂质 II 翻转酶 murJ 下游，且与 D - 丙氨酸转氨酶（dat）共转录，dat 参与细胞壁合成所需氨基酸的合成。

对 PepV 直系同源物分析发现，其可分为四个进化枝，金黄色葡萄球菌的 PepV 属于进化枝 A，该进化枝较为多样，部分蛋白除 M20 催化和盖子 / 二聚化结构域外还有其他结构域。此外，一些进化枝 A 的直系同源物，如金黄色葡萄球菌的 PepV，具有较长的盖子 / 二聚化结构域，且部分同源物预测有信号肽，如戈登链球菌的 PepV 在细菌培养物的细胞外环境中被发现。

PepV 的亚细胞定位

利用 SignalP 未能检测到金黄色葡萄球菌 PepV 的 N 端信号序列。为进一步探究其合成和亚细胞定位，构建了等基因 ΔpepV 突变体和质粒互补菌株（ΔpepV/p pepV），并在野生型（WT）菌株 RN4220 及 RN4220 ΔspaΔsbi 中进行实验，以排除 SpA 和 Sbi 对免疫信号的干扰。

实验中，用重组 PepV 制备兔多克隆血清（αPepV），对细菌培养物裂解物进行分级分离，包括培养基、细胞壁、细胞膜和细胞质等部分。通过 SDS - PAGE 分离各部分蛋白质，转膜后进行免疫检测。结果显示，在细胞质中可观察到免疫反应性的 PepV，在细胞膜部分也有少量存在，同时以膜蛋白分选酶 A（SrtA）作为对照。在携带互补质粒的 ΔpepVΔspaΔsbi/p pepV 菌株中，细胞质和细胞膜部分也能检测到对 PepV 的免疫反应，证明了互补效果。

此外，研究还发现 ΔpepV 细菌在生长曲线分析中，600nm 吸光度（A₆₀₀）出现小的滞后，通过用 BODIPY - 万古霉素染色观察发现，ΔpepV 细胞比 WT 细菌略小，推测细胞大小的减小可能是导致生长曲线吸光度滞后的原因。

PepV 对 SpA 表面展示的调节作用

通过显微镜观察金黄色葡萄球菌包膜中细胞表面蛋白的分泌和锚定过程，用胰蛋白酶处理细胞去除表面蛋白，然后分别在胰蛋白酶抑制剂存在下孵育 20min（T₂₀）或 40min（T₄₀），再用 BODIPY - 万古霉素和抗体染色。在 T₄₀时，与 WT 细胞相比，ΔpepV 细胞中 SpA 的荧光信号显著增强，但 SpA 在包膜上的总分布未受影响。免疫印迹分析也表明，在指数生长期的 ΔpepV 细菌的细胞质、细胞壁和培养基部分，SpA 的含量均高于 WT 细菌。

进行互补实验，在突变体（ΔpepV/p pepV）中异位表达 pepV，结果显示在 T₂₀和 T₄₀时，SpA 染色均减少。在 WT 细胞中过表达 pepV，同样导致 T₄₀时 SpA 染色减少。对于另一种带有 YSIRK/GXXS 基序的分选酶 A 锚定蛋白 ClfA，也观察到类似的染色减少现象，但对于缺乏该基序的 SasF 则没有影响。

PepV 对前体蛋白加工及锚定肽组成的影响

SpA 在细胞质中以前体形式合成，带有 N 端信号肽用于跨质膜转运，C 端分选信号用于通过分选酶 A 附着到肽聚糖上。信号肽具有特征性结构，SpA 的信号序列较长，其 n 区域有 11 个残基，且紧接 YSIRK/GXXS 基序。此前研究发现该区域可能在细胞质中进行预处理，因此探究 PepV 是否参与这一过程。

通过脉冲追踪实验，用 [³⁵S] 甲硫氨酸标记 WT 和 ΔpepV 细菌新合成的多肽，在不同时间点终止反应，免疫沉淀 SpA 并进行 SDS - PAGE 和 PhosphorImager 检测。结果显示，在缺乏 PepV 的情况下，前体 SpA 向成熟 SpA_ED的转化没有明显差异，也未检测到中间物种，表明 PepV 可能不参与 SpA 信号肽的加工过程。

由于 sortase A 有前体蛋白和脂质 II 两种底物，且 pepV 与 dat 共转录，dat 参与细胞壁合成，因此研究 PepV 是否影响分选反应的锚定产物。将 WT 和 ΔpepV 菌株用编码蛋白杂交体葡萄球菌肠毒素 B（SEB） - 单甲硫氨酸 - 六个组氨酸（MH₆） - 细胞壁分选（CWS）的质粒 pHTT4 转化，该融合蛋白可被分泌并通过分选酶 A 连接到肽聚糖上。

通过酶解、亲和纯化和基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI - TOF）光谱分析，结果显示 WT 和 ΔpepV 菌株的锚定肽组成没有差异，表明 PepV 不影响分选酶 A 反应的最终产物组成。

PepV、SecA 和 SpA 之间的相互作用

此前研究证实 SecA 是分泌含 YSIRK/GXXS 信号肽前体所必需的。通过串联质谱在下拉实验中发现，带有 N 端融合双 Strep - Tactin 序列（SecA_{TW - STREP}）的 SecA 从金黄色葡萄球菌裂解物中纯化时，可鉴定出与 PepV 匹配的肽段。本研究重复该实验，用携带质粒 borne SecA（p secA）或 SecA_{TW - STREP}（p secA_{TW - STREP}）的 WT RN4220 进行实验，免疫印迹分析证实了 SecA 和 PepV 在携带 p secA_{TW - STREP}的细菌样品中存在，而在携带 untagged SecA（p secA）的样品中未检测到。

尝试在金黄色葡萄球菌中标记 PepV 未成功，因此用来自大肠杆菌的 N 端六个组氨酸标记的 PepV（H6 - PepV）或 C 端六个组氨酸标记的 SecA（SecA - H6）与金黄色葡萄球菌裂解物孵育，经 Ni - NTA 珠纯化后进行 Western blot 分析。结果显示，SecA - H6 可与 PepV 结合，H6 - PepV 也可保留 SecA，且当用 Δspa 菌株的裂解物进行实验时，洗脱的 SecA 量比 WT 菌株少，表明 PepV 与 SecA 的相互作用可能依赖于 SpA。此外，用 IgG - Sepharose 珠下拉 SpA 时，在洗脱液中同时检测到 SpA 和 PepV，说明三者可能在细胞内形成复合物。

PepV 的自切割现象

为探究 PepV 是否能切割 YSIRK/GXXS 信号肽，以截短的 SpA 蛋白 pre - SpA_ED为底物进行体外实验。pre - SpA_ED带有 YSIRK/GXXS 信号肽及前两个 IgG 结合结构域 E 和 D，通过无细胞翻译系统制备并纯化。

实验中，将 pre - SpA_ED与纯化的 PepV、SecA、ATP 及非水解性 ATP 孵育，同时加入 EDTA 螯合酶辅因子抑制 PepV 活性。结果发现，EDTA 单独存在时可促进 PepV 自切割，且在 pre - SpA_ED存在时这种自切割现象加剧。

在体内实验中，免疫印迹分析发现 Δspa 细菌中 PepV 的丰度略高，进一步通过脉冲追踪实验，用 [³⁵S] 甲硫氨酸 / 半胱氨酸标记 WT 和 Δspa 细菌，结果显示在 SpA 缺失的情况下，³⁵S 标记的 PepV 在 60min 时仍可检测到，而在 WT 背景下 30min 后则无法检测到，表明 SpA 前体可刺激 PepV 自降解，导致其在体内的周转加快。

研究总结

本研究表明，细胞质中的 PepV 作为 M20 肽酶超家族成员，可调节 SpA 的表面展示。敲除 pepV 导致 SpA 和 ClfA 等含 YSIRK/GXXS 基序蛋白的表面展示增加；PepV 与 SpA、SecA 相互作用；SpA 前体可增强 PepV 的自降解，而敲除 spa 则使 PepV 稳定性增加。这些结果提示存在一个 SpA 与 PepV 之间的调节反馈回路，PepV 抑制 SpA 的表面展示，而 SpA 前体促进 PepV 的自降解以抵消其抑制作用。

虽然 PepV 通常被描述为二肽酶，但本研究发现其具有自切割活性，这在 M20 家族中尚未有报道。推测 PepV 与结合 SecA 的 SpA 前体相互作用可能是导致其自切割的生理触发因素，但不排除其他相互作用也会引发该现象。

此外，研究还发现 PepV 不影响分选酶 A 反应的最终产物结构，但不排除其或其他相关因子在协调分泌和脂质 II 可用性方面的作用。总体而言，本研究揭示了 PepV 对含 YSIRK/GXXS 基序前体蛋白表面展示的调节作用，但 PepV 发挥作用的具体机制，以及其对细胞大小和生长的影响等仍需进一步研究。