化脓性链球菌甘露糖磷酸转移酶系统（Man-PTS）：影响抗菌活性与鼻咽感染的关键因素

《Journal of Bacteriology》：The Streptococcus pyogenes mannose phosphotransferase system (Man-PTS) influences antimicrobial activity and niche-specific nasopharyngeal infection

本文聚焦化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes），发现其甘露糖磷酸转移酶系统（Man-PTS）参与非细菌素类抗菌物质产生，影响替代糖利用。Man-PTS 对鼻咽感染至关重要，但不影响皮肤感染，该研究为揭示细菌感染机制提供新视角。

　　

化脓性链球菌甘露糖磷酸转移酶系统（Man-PTS）影响抗菌活性和特定生态位的鼻咽感染

化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes），也被称为 A 群链球菌，是一种适应人体的病原菌，常定植于口咽和皮肤。它能引发多种疾病，从常见的咽炎、脓疱病，到严重的侵袭性感染，如坏死性筋膜炎、链球菌中毒性休克综合征等，每年全球因它导致的死亡人数超 50 万。尽管其致病机制已被广泛研究，但它与宿主内源性微生物群的相互作用仍有待深入探索。

化脓性链球菌产生与细菌素无关的抗菌化合物

化脓性链球菌可编码多种细菌素基因，为研究细菌素诱导，研究人员选用了从急性风湿热患者分离出的 M18 血清型菌株 MGAS8232。通过对 MGAS8232 基因组分析发现，它编码三种潜在细菌素，不过参与唾液链球菌素（salivaricin）生产的salMT基因存在缺失。同时，基因组中还编码两种 IIb 类细菌素（spbJK和spbMN） 。

研究人员利用延迟生物活性拮抗试验评估环境因素对细菌素诱导的影响。结果发现，在标准 Todd Hewitt Broth with 1% yeast（THY）琼脂、M17 琼脂上生长的 MGAS8232 无抗菌活性；而当 M17 培养基补充半乳糖（0.5% [w/v]）并在高浓度 CO₂环境下培养时，能检测到对藤黄微球菌（Micrococcus luteus）的抑制作用。此外，其他菌株如 HKU16 和 NGAS979 也能产生类似抗菌表型。

为确定抗菌表型是否由细菌素引起，研究人员构建了 IIb 类细菌素系统的缺失突变株（?spbJK、?spbMN和?spbJKMN）。实验结果显示，?spbJK和?spbMN菌株仍有抗菌活性，而?spbJKMN菌株虽失去抗菌活性，但在补充其他替代糖（如甘露糖、果糖、蔗糖）后又能诱导抗菌表型。对?spbJKMN菌株全基因组测序发现，其manN基因存在二次突变，这表明 SpbJK 和 SpbMN 肽并非该抗菌表型的产生原因。

抗菌表型是糖代谢的产物

为进一步确定参与抗菌化合物产生的基因，研究人员构建了野生型 MGAS8232 的转座子文库，使用卡那霉素抗性转座子（Krmit）进行大规模转座子鉴定。通过延迟生物活性拮抗试验筛选失去抗菌活性的转座子插入突变体，并利用任意引物 PCR 和全基因组测序确定转座子插入位点。研究发现，在manN基因起始处有转座子插入的功能缺失突变体，以及在galC（编码半乳糖 PTS 膜部分）和lacA（参与半乳糖和乳糖代谢）基因中也存在插入突变体。生长分析表明，这些突变体在 THY 和 M17 培养基中无明显生长缺陷，但目前尚未确定抗菌化合物的具体成分。这些结果表明，替代糖的代谢与针对藤黄微球菌的抗菌表型有关。

Man-PTS 对化脓性链球菌利用替代糖至关重要

Man-PTS 系统由manL、manM和manN三个基因编码，可能还包含下游基因manO ，但manO在化脓性链球菌中的作用尚不明确。为探究 Man-PTS 在化脓性链球菌生态位适应中的作用，研究人员构建了manLMN操纵子的框内缺失突变株（?manLMN），并进行 PCR 和全基因组测序验证。全基因组测序还发现了其他突变，因此研究人员利用 pDCerm 质粒对manLMN操纵子进行遗传互补，构建了?manLMN + manLMN和?manLMN + manL菌株。

实验结果显示，Man-PTS 突变体（?spbJKMN、manN::tn、?manLMN）利用半乳糖、甘露糖和 N - 乙酰葡糖胺的能力显著下降，而补充manLMN可恢复这些糖的利用能力，单独补充manL则无法恢复，且会降低果糖的利用能力。此外，?manLMN菌株在有替代糖半乳糖存在时无法产生抗菌物质，补充三个man基因后抗菌表型得以恢复。这表明 Man-PTS 在替代碳水化合物利用中起重要作用，且三个man基因对这些糖的利用和抗菌物质产生都是必需的。

Man-PTS 对葡萄糖的摄取很重要

鉴于 Man-PTS 在化脓性链球菌替代糖摄取中的重要作用，研究人员探究其是否影响其他 PTS 和通透酶。对 MGAS8232 和?manLMN缺失菌株在 THY（高葡萄糖）和 C - 培养基（低葡萄糖）中生长至对数后期 / 稳定前期（OD₆₀₀ ~0.8）时进行 RNA - seq 分析。

在高葡萄糖条件下，Man-PTS 缺陷导致约 22% 与 PTS 相关的基因显著上调，这些基因涉及抗坏血酸、纤维二糖和甘露醇的 PTS 组件，但海藻糖和果糖的 PTS 下调。在低葡萄糖环境中，只有乳糖 PTS 组件（EIIA，lacF.2）在 Man-PTS 缺陷菌株中显著上调。这些数据表明，Man-PTS 可能是 MGAS8232 中重要的葡萄糖转运体，在高葡萄糖环境下，Man-PTS 缺陷菌株可能通过其他 PTS 来适应葡萄糖摄取。

Man-PTS 不影响化脓性链球菌 MGAS8232 的主要调节因子或毒力因子

由于宿主环境营养缺乏且存在多种应激因素，化脓性链球菌编码了多种调节因子来辅助毒素产生和免疫逃避。以往研究表明，Man-PTS 会影响主要调节因子，如碳代谢物蛋白 A（CcpA）、mga和rgg2/3 。但在本研究的 RNA - seq 实验中，在体外高、低葡萄糖环境下，Man-PTS 缺失并未导致ccpA、mga或rgg2/3的转录变化。

在高葡萄糖条件下，Man-PTS 缺失仅使苹果酸双组分系统（maeRK）显著上调，这可能是因为在缺乏 Man-PTS 时，化脓性链球菌无法充分摄取葡萄糖，从而可能转向利用苹果酸作为能源。在低葡萄糖环境中，没有毒力调节因子表现出转录变化。

研究人员还研究了高、低葡萄糖环境下关键毒力因子的转录组谱。在高葡萄糖环境中，虽然一些毒力因子有变化趋势，但没有毒力因子的变化超过四倍且差异显著。在低葡萄糖环境中，噬菌体编码的链道酶（spd3）和透明质酸酶（hylP.1）显著下调。总体而言，RNA - seq 实验表明，Man-PTS 对 MGAS8232 的整体毒力影响不大。

Man-PTS 对鼻咽感染很重要，但对皮肤感染不重要

化脓性链球菌常定植于皮肤和鼻咽等部位。为评估 Man-PTS 在皮肤感染中的作用，研究人员使用表达主要组织相容性复合体（MHC） II 类分子（HLA - DR4 和 HLA - DQ8）的转基因小鼠（B6_HLA小鼠）进行皮肤感染实验。结果显示，野生型 MGAS8232 和?manLMN突变体感染小鼠后，在体重、病变大小、细菌载量和整体病理方面均无差异，表明 Man-PTS 在 MGAS8232 的实验性皮肤感染中不起作用。

在鼻咽感染实验中，B6_HLA小鼠经鼻内接种野生型 MGAS8232 或 Man-PTS 缺陷的?manLMN菌株。结果发现，在感染后 24 和 48 小时，?manLMN菌株感染的小鼠完整鼻甲中的细菌载量分别降低了 1000 倍和 10000 倍。这表明 Man-PTS 在 MGAS8232 建立鼻咽感染中很重要，但在皮肤感染中不重要。

讨论

共生菌和病原菌会利用多种机制在特定生态位中生存和共存。化脓性链球菌具有皮肤或咽喉嗜性，本研究发现其替代糖代谢，特别是与 Man-PTS 系统相关的代谢，在建立急性鼻腔感染而非皮肤感染中起作用，表明糖代谢可能对化脓性链球菌的生态位特异性很重要。

鼻咽和皮肤表面营养匮乏，葡萄糖含量低，但存在替代糖。Man-PTS 对肺炎链球菌（S. pneumoniae）的葡萄糖利用很重要，在化脓性链球菌中，它可能直接或间接参与碳代谢物阻遏。在高葡萄糖环境下，Man-PTS 缺陷菌株会上调多种 PTS，可能是为了适应葡萄糖摄取不足。此外，研究还发现了化脓性链球菌由替代糖代谢产生的抗菌活性，且该活性与细菌素无关，但抗菌化合物的具体成分仍未知。

不同研究中，Man-PTS 对化脓性链球菌毒力的影响存在差异。本研究中，在皮肤感染模型中未发现 Man-PTS 缺陷菌株与野生型菌株在病理上的差异，但在鼻咽感染模型中，Man-PTS 对建立感染至关重要。这可能与不同感染部位的糖环境以及细菌对碳代谢物的调控有关。

不同生态位的表面聚糖不同，鼻咽组织的聚糖富含半乳糖、甘露糖、N - 乙酰葡糖胺等，Man-PTS 突变体在利用这些糖方面存在缺陷，因此无法在鼻咽感染初期茁壮成长。本研究首次证实 Man-PTS 对建立鼻腔感染而非皮肤感染是必需的，表明其在生态位特异性中的作用。未来应进一步研究化脓性链球菌对聚糖中碳水化合物的利用，以确定对定植重要的碳水化合物。

材料和方法

研究中使用的细菌菌株和质粒信息详见相关表格。化脓性链球菌 MGAS8232 在 THY 培养基中培养，分子克隆使用大肠杆菌 XL1 - Blue 在 LB 或 BHI 培养基中培养，添加相应抗生素。固体培养基添加 1.5%（w/v）琼脂。

采用革兰氏阳性 / 大肠杆菌温度敏感穿梭载体 pG⁺host5 构建化脓性链球菌的缺失突变株，通过 PCR 和全基因组测序验证。利用 The Berkeley Drosophila Genome Project 和 Softberry 预测 Man-PTS 基因的启动子区域，将其克隆到 pDCerm 质粒中构建互补菌株。

延迟拮抗生物活性试验用于鉴定化脓性链球菌 MGAS8232 的抗菌表型。将 MGAS8232 在添加不同糖类和碳酸钙的 M17 琼脂上培养，以藤黄微球菌为指示菌株，观察是否存在抑菌圈。

使用 pKrmit 系统构建化脓性链球菌 MGAS8232 的随机诱变转座子文库，通过计算转座频率和非生产性整合率筛选合适的菌落，利用任意引物 PCR 和全基因组测序鉴定转座子突变体。

对化脓性链球菌的缺失突变体和转座子突变体进行全基因组测序，使用 SPAdes 进行从头组装，Prokka 进行注释，Snippy 分析突变。

从在高葡萄糖（THY）和低葡萄糖（C - 培养基）中生长的细菌中提取 RNA，使用 Agilent 2100 Bioanalyzer 检测 RNA 完整性，对合格样本进行 Illumina RNA 测序。利用 HISAT2 进行 reads 比对，R 和 edgeR 的 TMM 算法进行归一化和差异表达分析。

采用 API 50CH 系统检测化脓性链球菌对 49 种糖的利用情况。将细菌接种到 API 条带中，在厌氧环境下培养 24 小时，根据 pH 指示剂颜色变化判断糖利用情况。

使用底特律 562 人咽癌细胞系进行侵袭试验，采用改良的庆大霉素保护试验评估细菌内化数量。

小鼠实验遵循加拿大动物护理委员会指南，经相关委员会批准。皮肤感染模型中，B6_HLA小鼠皮下接种细菌，观察体重、病变大小，感染 72 小时后收获病变组织并计数细菌数量。急性鼻咽感染模型中，B6_HLA小鼠经鼻内接种细菌，在感染后 24 或 48 小时处死，提取鼻组织并计数细菌数量。