pH 调控下阿拉斯加脱硫弧菌 G20 的奥秘：解锁环境适应与生物修复新密码

《Applied and Environmental Microbiology》：pH-dependent genotypic and phenotypic variability in Oleidesulfovibrio alaskensis G20

这篇研究聚焦于硫酸盐还原菌（SRB）中的阿拉斯加脱硫弧菌（Oleidesulfovibrio alaskensis）G20，探究其在不同 pH 条件下的生长动态、代谢基因表达变化。研究发现其通过多种机制维持 pH 稳态，该成果为优化生物修复和厌氧消化过程提供了关键依据。

　　

研究背景

硫酸盐还原菌（SRB）广泛分布于海洋沉积物、废水系统和油藏等多样环境，在全球硫和碳循环中发挥关键作用，对生物修复和厌氧消化过程至关重要。其代谢受环境因素影响，尤其是 pH 值，pH 波动会改变细胞内 pH 稳态，进而影响 SRB 的生长、代谢、生化过程和生理功能。尽管 SRB 在生态系统中意义重大，但关于其在不同 pH 条件下的基因型和表型响应的详细研究有限。本研究以嗜中性 SRB—— 阿拉斯加脱硫弧菌（Oleidesulfovibrio alaskensis）G20 为模型，深入探究其在酸性和碱性环境中的 pH 稳态维持机制，旨在填补这一知识空白，为相关领域应用提供理论支持。

材料与方法

1. 细菌菌株与生长条件：实验所用的 O. alaskensis G20 菌株来自实验室收集，最初由 Sani 等人分离获得。采用厌氧分批培养法，在 125 mL 血清瓶中进行培养，以乳酸 C 培养基为生长培养基，其中含有 60 mM 乳酸钠作为电子供体，50 mM 硫酸钠作为电子受体。通过添加 5N 盐酸或 5M 氢氧化钠调节培养基 pH 值，使其分别达到 4 - 8 的不同水平。培养基经高压灭菌、脱氧处理后，接入 5%（vol/vol）的种子培养物，培养物来源于 - 80°C 保存的 40% 甘油菌悬液，接种前需用过滤除菌的超纯氮气吹扫 1 h 以去除硫化氢（H?S）。培养过程中，将血清瓶置于 30°C 恒温摇床，以 125 rpm 的转速持续振荡培养，实验设置三个生物学重复以确保结果可靠性。
2. 生长统计测量：使用分光光度计在 600 nm 波长处测定 O. alaskensis G20 细胞在不同 pH 条件下的生长情况，每 24 h 记录一次数据，持续 6 天。利用指数拟合曲线（在 Polymath 软件中进行拟合）分析生长数据，计算最大比生长速率（μ_max），公式为 N_t = N₀×exp (μt)，其中 N_t和 N₀分别代表初始和最终细胞数量，μ 表示比生长速率，假设在封闭系统中 OD 值的增加与细胞数量的增加成正比。
3. 乳酸消耗测量：采用离子交换色谱法（配备电导检测器和 Dionex IonPac AS22 柱）测定乳酸消耗。从血清瓶中吸取 1.5 mL 细菌培养物至 2 mL Eppendorf 管，经 6,500×g 离心 10 分钟去除细胞，上清液再用 0.22 μm 滤膜过滤以获得无细胞上清液。使用 1 M 乳酸钠储备液配制乳酸标准品，浓度分别为 0、5、10、25、50 和 75 mM，用于绘制标准曲线。
4. 总 RNA 提取：在 O. alaskensis G20 培养的对数生长期和稳定期，从血清瓶中收集 10 mL 液体培养物，在 4°C 下以 6,500×g 离心 10 分钟收集细胞沉淀。沉淀用厌氧磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）洗涤三次后，转移至无菌 2 mL 微量离心管中。所有操作均在厌氧培养箱中进行，以维持严格的无氧环境。使用完整的 DNA 和 RNA 纯化试剂盒按照说明书提取总 RNA，用 Tris - EDTA 缓冲液洗脱。采用 Nanodrop 紫外 - 可见分光光度计评估 RNA 纯度，使用 Qubit RNA 检测试剂盒和 Qubit 3.0 荧光计确定 RNA 浓度，通过 Bioanalyzer 2100 系统进行电泳分析 RNA 完整性。
5. cDNA 合成与定量实时 PCR：为研究酸性和碱性条件下与细胞存活相关的基因变异，利用 RT - PCR 技术分析参与 pH 稳态调节的关键基因。首先，从 1.5 μL 提取的总 RNA 中合成 cDNA，使用 QuantiTect 逆转录试剂盒。然后，在 QuantStudio 3 实时 PCR 系统中进行 RT - qPCR 反应，采用 Maxima SYBR Green/ROX qPCR Master Mix，在 0.2 mL PCR 管中进行扩增。以 16S rRNA 基因为内参进行 PCR 扩增和数据标准化，使用 2^?ΔΔCT方法计算对照组（pH 7）和实验组（pH 6 和 8）之间的相对表达水平，基因表达数据以 2^?ΔΔCT值的以 2 为底的对数（log2FC）表示。所有实验均独立重复三次，计算平均值和标准误差。
6. 氢气测量：使用配备热导检测器和 3'×1/8" 分子筛 5A 填充柱的气相色谱仪测定每批培养物顶空中氢气的产生和消耗。以氩气为载气（40 psi），色谱仪保持 14 psi 的恒定压力，柱温按照 Samanta 等人的方法从 150°C 逐步升至 250°C，每次升温 10°C。氢气峰在 0.72 分钟的保留时间处被检测到，记录相应的峰面积。通过与已知浓度的校准曲线对比，确定氢气浓度，每 24 h 测量一次，持续 6 天。
7. 细胞形态可视化：采用场发射扫描电子显微镜（FESEM，Zeiss Supra40 可变压力）观察 pH 6、7 和 8 条件下浮游细胞的形态。在实验第 2 天和第 4 天，从血清瓶中取出 1 mL 浮游培养物，经 3,250×g 离心 5 分钟收集细胞沉淀，用 pH 7.2 的 PBS 洗涤。洗涤后的细胞沉淀用含有 0.1 M 醋酸钠缓冲液和 2% 戊二醛的溶液固定，先在 4°C 下固定过夜，然后在室温下再固定 1 小时。随后，细胞依次用 50%、75%、95% 和 100% 的乙醇脱水，每次 30 分钟，最后在干燥器中过夜干燥。在 3 kV 加速电压下进行二次电子成像获取 SEM 图像，分别以 8,000× 和 12,000× 的放大倍数进行观察，并沿一维线性轴测量细胞长度（细胞计数 3 ≤ n ≤ 7）。
8. 粗胞外多糖的提取与定量：在实验第 2 天和第 4 天，从每个血清瓶中无菌转移 10 mL 培养液至 50 mL Falcon 管，经 6,500×g 离心 10 分钟分离细胞和培养液。为确保完全去除细胞，上清液再用 0.22 μm 注射器滤膜过滤。将无细胞上清液与等体积预冷的无水乙醇（-20°C）在冰浴中逐滴加入并持续搅拌，然后置于 - 20°C 过夜，再以 10,000 rpm 离心 40 分钟。所得沉淀用 1 mL 去离子水溶解。采用苯酚 - 硫酸法测定总碳水化合物含量，以葡萄糖为标准品；使用 Qubit 蛋白质宽范围（BR）检测试剂盒和 Qubit 3.0 荧光计测定蛋白质含量；通过 Nanodrop 紫外 - 可见分光光度计在 260 nm 波长处测量核酸含量。以未接种的培养基作为对照，通过减去对照培养基中的相应值，计算 EPS 中碳水化合物、蛋白质和核酸的含量。

结果与讨论

1. pH 对 O. alaskensis G20 细胞生长和乳酸消耗的影响：不同 pH 条件下，O. alaskensis G20 细胞的生长存在显著差异。pH 7 和 6 时细胞生长最佳，μ_max分别为 0.016 h^?1和 0.014 h^?1；pH 8 时 μ_max较低，为 0.010 h^?1；pH 4 时几乎无明显生长（μ_max = 0.002 h^?1）。乳酸消耗与细胞生长呈正相关，pH 7 时乳酸消耗速率最高，为 0.35 mM 乳酸?h^?1；pH 6 时次之，为 0.17 mM 乳酸?h^?1；pH 8 时最低，为 0.09 mM 乳酸?h^?1。在实验过程中，pH 8 的培养基在第 2 天接近 pH 7，并在后续 4 天保持稳定；pH 6 的培养基在第 3 天达到 pH 7 并继续生长。这表明 O. alaskensis G20 细胞偏好 pH 7 的环境，极端酸性（如 pH 4）对其生长极为不利。H?CO?和 H?S 作为弱酸，其解离平衡在维持环境 pH 稳定中起重要作用。在碱性条件（如 pH 8）下，H?CO?和 H?S 解离增强，释放质子，使环境 pH 向中性靠近；在酸性条件（如 pH 6）下，平衡向质子化形式移动，消耗质子，同样促使 pH 向中性变化。在 pH 7 时，H?CO?（pKa = 6.4）和 H?S（pKa = 7.0）的质子化和去质子化形式比例近似相等，维持了 pH 的稳定。
2. 酸性和碱性 pH 暴露导致的基因表达变化：嗜中性细菌需维持细胞质 pH 在 7.4 - 7.8 之间以适应不同环境。O. alaskensis G20 细胞在实验过程中能将 pH 维持在约 7.3，表明其具备强大的 pH 稳态调节机制。在面对碱性胁迫时，细胞会采取多种策略来缓解细胞质碱化、维持膜电位和保护蛋白质，如主动向细胞质泵入质子、导入或合成酸化细胞质的化合物以及激活蛋白质修复或降解系统等；在酸性胁迫下，则采取相反的机制，如排出细胞质中的质子和诱导碱性代谢合成。
   • 异化硫酸盐还原（DSR）：DSR 代谢途径包含一系列复杂的酶促反应，最终将硫酸盐还原为硫化物。在不同 pH 条件下，H?S 的存在形式不同，对 DSR 过程产生影响。在 pH 6 时，高浓度的 H?有利于未解离的 H?S 形成；在 pH 8 时，高浓度的 OH?促进 H?S 解离，降低其毒性。基因表达分析显示，在生长阶段，pH 6 时 sat 和 dsrAB 基因上调，pH 8 时 dsrA 基因上调但 dsrB 基因上调不显著。这与乳酸消耗数据相符，即 pH 6 时乳酸消耗高，产生更多 H?S，且主要以未解离形式存在；pH 8 时乳酸消耗低，H?S 产量减少，且更易解离，有助于中和环境中的 OH?，使 pH 接近 7。在稳定期，pH 6 和 pH 8 的细胞培养物向中性 pH 转变，dsrAB 基因表达下调，乳酸消耗减少，表明 DSR 活性降低。
   • 氢酶：氢酶在氢代谢中起关键作用，可催化分子氢（H?）与质子（H?）的可逆转化。本研究中，O. alaskensis G20 细胞在不同 pH 条件下的 H?产生模式不同。pH 6 时，最初 H?释放量较高，为 7.6 mL H?/L_medium，但随后逐渐下降，第 4 天时降至 1.2 mL H?/L_medium；pH 8 时，初始 H?产量更高，为 18.9 mL H?/L_medium，但第 3 天后降至 3.5 mL H?/L_medium，且第 4 天和第 5 天后分别在 pH 6 和 pH 8 条件下检测不到氢气。pH 7 时整个实验过程中均未检测到氢气产生。在酸性条件下，高浓度的 H?有利于 H?生成反应的正向进行，但随着氢气积累，氧化还原电位升高会反馈抑制氢酶活性，同时培养基中的硫酸盐作为电子受体可将硫酸盐还原为硫化物，积累的未解离 H?S 会抑制氢酶活性，导致 H?产量下降。在碱性条件下，氢酶稳定性提高，初始 H?产量较高，但高 pH 下 H?浓度降低限制了 H?生成速率，且底物限制和电子供体耗尽最终导致 H?产量下降。在中性 pH 下，氢酶催化的反应达到平衡，H?生成和消耗速率相等，无净 H?积累。NiFeSe 和 hyd 氢酶的表达与 H?产生相关，在生长阶段，pH 6 和 pH 8 时 NiFeSe 均上调，在稳定期，pH 6 时 NiFeSe 下调，pH 8 时略有上调但不显著；hyd 在生长阶段 pH 6 和 pH 8 时均上调，稳定期 pH 6 时仍上调，pH 8 时上调不显著。
   • 中心碳代谢：乳酸脱氢酶（LDH）在不同 pH 条件下的表达和活性变化影响乳酸代谢。在指数生长期，pH 6 时 LDH 表达下调，进入稳定期后上调，且此时 pH 6 接近 pH 7，乳酸消耗速率增加；pH 8 时，生长阶段 LDH 表达上调，稳定期上调幅度较小，且稳定期 pH 8 接近 pH 7，乳酸消耗在第 4 天后不显著。丙酮酸甲酸裂解酶 1 激活酶（PFL）在 pH 6 时表达下调，在 pH 8 时表达上调，表明 pH 8 时可能通过增加甲酸生成来平衡碱性条件。甲酸脱氢酶（FDH）在 pH 6 生长阶段下调，在 pH 8 生长阶段略有上调，稳定期 pH 6 继续下调，pH 8 继续上调，说明在 pH 8 时 FDH 可能对建立质子梯度更重要。丙酮酸羧化酶（PC）在 pH 6 生长阶段下调，在 pH 8 稳定期上调，反映了细胞对不同 pH 条件的代谢适应。
   • 细胞分裂协调：细菌细胞分裂涉及多个基因的协调作用，其中 ftsZ、ftsQ 和 ftsA 基因起关键作用。ftsZ 是 Z 环蛋白结构的关键成分，影响细胞分裂和隔膜形成。在本研究中，在指数生长期，酸性和碱性条件下 ftsZ 基因均下调；在稳定期，酸性条件下 ftsZ 基因仍下调，碱性条件下则上调。ftsA 基因在酸性条件下转录被诱导，但在生长阶段和稳定期，pH 6 和 pH 8 时均下调。ftsQ 基因在生长阶段 pH 6 时下调，pH 8 时上调，稳定期保持类似模式，表明细胞分裂对 pH 变化敏感。
   • 氨基酸合成：在低外部 pH 条件下，氨基酸脱羧酶等酶可通过产生胺来逆转酸化；在碱性胁迫下，氨基酸消耗可使细胞质质子化，减轻碱性影响。在本研究中，o - 乙酰丝氨酸巯基酶 A（CysK）在 pH 6 生长阶段显著下调，在 pH 8 生长阶段和稳定期均上调，其作用是产生氨和乙酸盐，与在碱性条件下高表达、酸性条件下低表达的报道相符。谷氨酰胺合成酶（GLS）在生长阶段 pH 6 和 pH 8 时均下调，在稳定期均上调，表明其在中性 pH 下功能最佳，与稳定期 pH 6 和 pH 8 趋近于 pH 7 的条件一致。
   • F₀ - F₁ATP 酶：ATP 合酶复合物由 F₀和 F₁两个组件组成，F₀形成质子通道，F₁合成 ATP，其活性受多种因素调节。在本研究中，pH 6 时，F₀ - F₁ATP 酶相关基因（atpA、atpH、atpD 和 atpB）在生长阶段和稳定期均显著下调，表明酸性条件下细胞为避免进一步质子内流和能量消耗，减少 ATP 水解；pH 8 时，生长阶段多数基因下调，稳定期 atpB 和 atpD 基因上调，表明细胞在适应碱性条件时，通过调节基因表达维持 ATP 合成和质子梯度稳定。
   • 转运蛋白：Na?/H?反向转运蛋白（如 NhaA）在维持细胞内 pH 平衡和离子稳态中起重要作用。在本研究中，NhaA 在 pH 6 生长阶段和稳定期均下调，在 pH 8 生长阶段轻微下调，稳定期上调，与文献中其在碱性 pH 下活性增强的报道相符。细胞色素 c3 氢酶（cyh 基因编码）在 pH 6 时下调，在 pH 8 时上调，可能与碱性条件下优化电子转移和血红素配体结合有关。组氨酸激酶（HK）在 pH 6 时下调，在 pH 8 时轻微上调，表明其表达受 pH 调节。abcB 和 abcP 基因分别编码转运支链氨基酸和极性氨基酸的转运蛋白，在 pH 6 生长阶段均下调，在 pH 8 生长阶段 abcB 上调、abcP 下调，稳定期 pH 6 时均下调，pH 8 时均上调，说明酸性条件下氨基酸向细胞外的转运减少，碱性条件下可能通过增加氨基酸转运来平衡氢氧根离子。PAS 传感器系统在维持细胞内外氧化还原电位方面起作用，在 pH 6 生长阶段下调，在 pH 8 生长阶段显著下调，稳定期 pH 8 时上调，其在极端 pH