耳念珠菌（Candida auris）与解脂念珠菌复合群生物学特性、氟康唑耐药性及热适应机制的比较分析：为临床防治提供关键依据

《Applied and Environmental Microbiology》：Comparative analyses of the biological characteristics, fluconazole resistance, and heat adaptation mechanisms of Candida auris and members of the Candida haemulonii complex

这篇研究聚焦耳念珠菌和解脂念珠菌复合群（Candida haemulonii complex），分析了二者的生物学特性、氟康唑耐药性和热适应机制。研究发现它们在多方面存在差异，这些结果为深入了解念珠菌感染的发病机制及临床治疗提供了重要参考。

　　### 研究背景
真菌作为自然生态系统中的主要分解者，部分可成为人类病原体。核心体温是限制人类感染致病性真菌的主要因素，了解致病真菌的耐热机制有助于防控真菌感染。耳念珠菌和解脂念珠菌复合群是近年来出现的多重耐药真菌，可引发严重医院感染，死亡率高，二者亲缘关系近但常被误诊，其致病性、热适应和耐药机制尚不清楚。本研究旨在比较二者的耐热性、抗真菌药敏性、对氟康唑（FLC）的耐药性和毒力，并探究其耐热机制，为防治提供新见解。

材料与方法

1. 菌株与培养：从住院患者标本中分离出解脂念珠菌变种（C. haemulonii var. vulnera，菌株ch）、杜氏解脂念珠菌（C. duobushaemulonii，菌株cd、cd2、cd3、cd1）和耳念珠菌（C. auris，菌株cau、cau03、cau13），经测序鉴定后，在酵母提取物 - 蛋白胨 - 葡萄糖（YPD）培养基上活化，用于后续实验。
2. 最佳培养温度和菌落形成单位（CFUs）定量：将活化菌株在不同浓度（10³、10⁴、10⁵、10⁶ cells/mL）下，于 28℃、37℃、39℃、41℃静态培养，观察形态特征并选择合适温度继续实验。同时，在不同时间点定量 CFUs，确定热响应的精确时间点。
3. 抗真菌药物敏感性测试：采用肉汤微量稀释法，评估两性霉素 B（AMB）、阿尼芬净（ANI）等多种抗真菌药物对菌株的活性，以白色念珠菌（C. krusei）6258 和近平滑念珠菌（C. parapsilosis）22019 为内部对照，计算最低抑菌浓度（MIC）。
4. 黏附、生物膜形成和生理活性测定：将菌株在不同温度下培养后，进行黏附、生物膜形成和生理活性测定。黏附实验通过测量特定波长下的吸光度评估；生物膜形成实验经固定、染色、脱色后测吸光度计算生物膜质量；生理活性通过添加特定试剂后测吸光度评估。
5. 疏水性测试：将真菌细胞与环己烷混合，通过测量水相吸光度计算疏水性值。
6. 天冬氨酸型蛋白酶和磷脂酶活性测定：采用牛血清白蛋白（BSA）平板法和蛋黄平板法分别测定菌株的天冬氨酸型蛋白酶和磷脂酶活性，计算 Pz 值评估酶活性。
7. 毒力测定：以大蜡螟（Galleria mellonella）幼虫为感染模型，将真菌细胞悬液注入幼虫腹腔，观察幼虫存活情况并计算 CFUs，评估菌株毒力。
8. 不同温度下真菌菌株的生长：将真菌溶液调整浓度后，在不同温度下培养 120 h，每隔 12 h 取样，用 XTT 法评估生长情况并绘制生长曲线。
9. RNA 分离和实时定量聚合酶链反应（RT - qPCR）分析：在特定条件下培养真菌细胞后提取 RNA，反转录为 cDNA，设计引物以 β - 肌动蛋白（ACT1）基因为内参，通过 RT - qPCR 分析相关基因表达水平。
10. 转录组测序和分析：对不同温度处理后的菌株进行转录组测序，经数据过滤、比对参考基因组后，进行质量评估、结构分析、差异表达分析、基因功能注释和功能富集分析。
11. 细胞内活性氧（ROS）和丙酮酸测量：将菌株在不同温度下培养，收集细胞后分别用探针检测 ROS 水平，用试剂盒测量丙酮酸含量，并在不同丙酮酸浓度下测量 ROS 水平和存活率。
12. 统计分析：使用 GraphPad Prism 9 软件进行统计分析，Mantel - Cox 检验评估大蜡螟幼虫存活率，t 检验和单因素方差分析分别用于两组及多组间差异显著性判断，P < 0.05 为差异有统计学意义。

研究结果

1. 菌株鉴定和最佳生长温度：通过酵母点种试验确定了菌株的耐热性，耳念珠菌菌株可耐受 41℃，解脂念珠菌复合群中部分菌株在 28℃生长良好，随温度升高生长受抑制。选取差异显著的cau、cd、ch菌株进一步研究。
2. 测试菌株的药敏性：cd和ch菌株对 FLC、伏立康唑（VRZ）等多种药物敏感性降低，cau菌株对更多药物敏感性降低。
3. 致病性和毒力因子表达模式的差异：以白色念珠菌 MYA - 2876 为对照，在大蜡螟幼虫感染模型中，白色念珠菌毒力最强，cau和ch次之，cd最弱。但cd和ch产生的真菌负荷最高，cau和白色念珠菌死亡率最高。在毒力因子方面，ch黏附能力最强，cau疏水性和生物膜形成能力最强，cau分泌天冬氨酸酶，而三者磷脂酶活性无显著差异。
4. 生长活性、热响应时间和热响应机制的差异：用 XTT 法测量菌株在热应激下的生理活性，发现cau在 39℃和 37℃生长曲线相似，41℃时增殖略有下降；cd和ch在 37℃和 39℃增殖受抑制。通过量化 CFUs 确定热响应时间点，分析不同时间点常见耐热基因表达，发现三种菌株对热应激的反应存在差异。
5. 菌株cau的热响应机制：转录组分析发现，cau在 39℃和 41℃培养 12 h 后有 627 个差异表达基因，集中在葡萄糖代谢和铁转运途径。相关基因表达变化导致丙酮酸积累和铁摄取增加，RT - qPCR 结果与转录组数据一致。
6. 菌株cd的热响应机制：cd在 37℃和 39℃培养 8 h 后有 473 个差异表达基因，丙酮酸脱氢酶复合物相关基因和部分其他基因表达下调，低亲和力葡萄糖转运蛋白基因表达上调，RT - qPCR 结果与转录组数据相符。
7. 菌株ch的热响应机制：ch在 37℃和 39℃培养 1 h 后有 521 个差异表达基因，参与丙酮酸生成的基因表达上调，丙酮酸脱氢酶基因表达下调，RT - qPCR 结果证实了基因表达变化与热应激反应相关。
8. 菌株cau、cd和ch对热应激的响应机制：测量三种菌株在热应激下的丙酮酸浓度，发现随温度升高丙酮酸含量和细胞内 ROS 水平增加，丙酮酸积累有助于清除 ROS。添加丙酮酸激酶抑制剂或丙酮酸改变丙酮酸浓度后，发现丙酮酸浓度影响 ROS 水平和菌株存活率。此外，铁摄取增强可提高cau对热应激的抗性。

讨论

耐药真菌感染增加了重症住院患者的死亡风险，耳念珠菌和解脂念珠菌复合群的出现加剧了医院感染问题。本研究揭示了二者在耐药性、毒力、耐热性及热应激抵抗机制方面的差异。
在耐药性上，研究中测试菌株对 FLC 普遍耐药，部分解脂念珠菌复合群菌株对棘白菌素类药物耐药，表明其耐药性进一步进化。毒力方面，耳念珠菌在大蜡螟幼虫模型中致病性更强，体外分析也发现菌株间黏附、疏水和生物膜形成能力存在差异。耐热性上，耳念珠菌比解脂念珠菌复合群更耐高温，且三种菌株在热应激下丙酮酸积累和消耗方式不同。铁在细胞代谢中起重要作用，cau在热应激下铁摄取和利用相关基因及氧化酶表达上调，可能通过调节丙酮酸动态平衡来抵抗热应激，但具体调控机制需进一步研究。

结论

多重耐药真菌的出现给全球医疗带来挑战。本研究虽使用的临床分离株有限，但综合比较分析揭示了耳念珠菌和解脂念珠菌复合群在致病性和热应激保护机制上的差异。耳念珠菌通过维持细胞内铁离子水平、积累丙酮酸和上调GRX5和AOX基因表达抵抗热应激，解脂念珠菌复合群仅通过积累细胞内丙酮酸抵抗热应激。这些结果为临床用药和预防感染提供了有用参考。