金黄色葡萄球菌在替加环素压力下实验室适应性进化的表型和遗传变化：揭示耐药机制与潜在靶点

《Antimicrobial Agents and Chemotherapy》：Phenotypic and genetic stepwise changes in Staphylococcus aureus during in vitro adaptive laboratory evolution under the selective pressure of tigecycline

这篇研究通过适应性实验室进化（ALE）获得高水平替加环素耐药金黄色葡萄球菌突变株（TRSAms），从表型和基因层面探究其耐药机制。发现 yycH 基因与替加环素敏感性相关，为理解耐药机制和寻找潜在抗菌靶点提供依据。

　　

引言

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种能引发肺炎、心内膜炎和菌血症等传染病的病原菌。替加环素（tigecycline）作为一种糖肽类抗菌剂，对耐多药细菌有效，但目前已出现替加环素耐药的金黄色葡萄球菌（TRSA）菌株，明确其耐药分子机制对防控 TRSA 传播至关重要。

适应性实验室进化（ALE）可用于研究细菌耐药性演变并发现潜在治疗靶点。在大肠杆菌和鲍曼不动杆菌中，已通过 ALE 确定了与替加环素耐药相关的基因。在金黄色葡萄球菌中也有相关 ALE 研究，但此前所选突变株的替加环素最低抑菌浓度（MIC）相对较低，可能导致未发现更多耐药机制。本研究旨在揭示 TRSA 突变株（TRSAms）与替加环素耐药相关的表型和基因综合变化，并探索维持金黄色葡萄球菌对替加环素敏感性的潜在机制。

材料和方法

1. 筛选降低对替加环素敏感性的菌株：对 ATCC 25923、ATCC 29213 和 ATCC 43300 三株金黄色葡萄球菌在替加环素选择压力下连续传代培养，获得耐药突变株，并在无替加环素的琼脂上培养 10 代以确认突变株稳定性，根据菌株缩写和替加环素 MIC 变化命名突变株，当替加环素 MIC 连续 10 天不再增加时结束筛选。
2. 抗菌药敏试验：以 ATCC 29213 为质量控制菌株，采用肉汤微量稀释法测定替加环素 MIC，依据欧洲抗菌药敏试验委员会标准（第 12.0 版）操作；其他抗菌剂采用琼脂微量稀释法，按照临床和实验室标准协会指南进行检测。
3. 外排泵抑制试验：采用肉汤微量稀释法，在有或无外排泵抑制剂（EPIs）存在的情况下测定对替加环素的 MIC，评估外排泵活性与替加环素耐药性的关系，所用 EPIs 包括 2 μM 羰基氰化物 3 - 氯苯基腙（CCCP）、100 mg/L 1 -（1 - 萘基甲基） - 哌嗪（NMP）和 20 mg/L 利血平（RS），通过两倍稀释（TFD）评估抑制水平降低情况。
4. RNA 提取和转录水平评估：用 RT - qPCR 评估 mepA 基因表达水平。使用 RNA 分离试剂盒提取总 RNA，立即用 cDNA 合成试剂盒进行逆转录。以 gyrB 基因为管家基因，在 CFX Connect 仪器上用两步法 SYBR Green 预混液进行 qPCR，根据引物扩增，采用 ΔΔCT 法计算 mepA 和 yycH 相对转录水平。
5. 适应性代价评估：通过生长速率测量、自溶试验和突变频率测定评估适应性代价。生长速率测量是将菌株过夜培养后稀释 1/100，在 37°C、180 rpm 条件下培养，每 30 min 测定一次 600 nm 处光密度（OD₆₀₀），共测 8 h，通过线性回归斜率分析比较生长速率；自溶试验是将过夜培养菌株用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次后重悬，调整 OD₆₀₀约为 1.00，添加 0.5 mg/L 溶葡萄球菌素诱导自溶，每 30 min 读取一次 OD₆₀₀值，共测 4 h，将初始值设为 100%，其他值按与初始数据的百分比计算；突变频率测定是将过夜培养菌株重悬于 1/10 体积生理盐水中，用生理盐水进行 8 次 10 倍连续稀释，将菌液涂布在含和不含利福平（100 mg/L）的脑心浸液（BHI）琼脂平板上，24 h 后计数菌落，通过利福平耐药突变菌落数除以总细胞数计算突变频率。
6. 毒力评估：体外评估溶血活性，将过夜培养菌株用生理盐水洗涤，调整 OD₆₀₀为 1.0，用 PBS 缓冲液稀释无菌羊血制成 4% 红细胞（RBCs），将细菌细胞与 4% RBCs 按 1:1 比例混合，37°C 孵育 3 h 后 1,500 × g离心 5 min，通过测定上清液 OD₆₀₀值评估溶血活性，以等体积 PBS 缓冲液为阴性对照，结果为扣除阴性对照值后的数值。体内构建金黄色葡萄球菌感染大蜡螟（Galleria mellonella）模型，将不同替加环素 MIC（2 - 128 mg/L）的 TRSAm 菌株及其亲本菌株培养至 10⁹菌落形成单位（CFUs）/mL，离心后用生理盐水重悬，分别向大蜡螟注射 10 μL 菌悬液或生理盐水进行感染或对照，每 8 h 观察一次大蜡螟存活情况，共观察 24 h。
7. 全基因组测序和数据分析：用试剂盒按标准方案提取细菌 DNA，利用 Illumina Novaseq 6000 测序平台进行全基因组测序（WGS），用 CLC Genomics Workbench version 10.1 软件组装 Illumina Novaseq 序列。通过 ABRicate 创建自有数据库扫描全球基因组数据，从 GenBank 数据库下载所选基因组数据。用 Prokka version 1.14.6 注释菌株 WGS 数据，用 Snippy version 4.6.0 分析单核苷酸变异（SNVs），用特殊引物扩增检测到的 SNVs 并进行 Sanger 测序确认核苷酸序列。用 mlst 和 spaTyper 鉴定金黄色葡萄球菌分子类型，用 Parsnp 构建核心基因组比对进行系统发育分析，用 RaxML 基于 GTRGAMMA 替换模型推断最大似然树。WGS 数据存入 GenBank 数据库，生物项目登录号为 PRJNA1066721。
8. 感受态细胞制备和电穿孔：将金黄色葡萄球菌在 BHI 肉汤中过夜培养，取 1 mL 过夜培养物加入 100 mL 新鲜 BHI 中，37°C 培养至 OD₆₀₀值为 0.2，离心后用冰预冷的 0.5 M 蔗糖水溶液洗涤细胞，并重悬于 1 mL 0.5 M 蔗糖水溶液中。取约 100 μL 蔗糖水溶液重悬的细胞加入 1 μg DNA，冰上孵育 15 min，用 MicroPulser 电穿孔仪进行电穿孔，参数为 2.5 kV、200 Ohm 和 25 μF。电穿孔后细胞在胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中复苏 2 h，离心后重悬于 100 μL TSB，接种于含抗菌剂的胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板。用引物 vLI - F 和 vLI - R 进行 PCR 扩增和 Sanger 测序确认电穿孔成功。
9. 突变体的功能互补：用穿梭载体 pLI50 构建互补质粒，从亲本菌株基因组 DNA 中扩增目标基因及其原始启动子，用无缝克隆试剂盒插入载体。用定点突变试剂盒对 rpsJ 基因的 Asp60Tyr 和 Lys57Gln 进行点突变，用 PrimerX 设计引物。用试剂盒提取所有质粒，将质粒电转化到金黄色葡萄球菌 RN4220 中，再转入 TRSAms。
10. 缺失突变体构建和互补：选择金黄色葡萄球菌 ATCC 29213 构建 yycH 基因缺失突变体及其互补菌株。用穿梭载体 pHoss - 1 通过等位基因交换删除 yycH 基因，将 yycH 基因两侧 800 bp 以上 DNA 区域扩增纯化后克隆到经 EcoR I 线性化的 pHoss - 1 中，得到缺失突变体质粒 pHoss - hyycH，电转化到 ATCC 29213 中，经一系列筛选确认 yycH 基因缺失，命名缺失突变株为 29213ΔyycH。从 ATCC 29213 扩增原始 yycH 基因，从 m29213T128 扩增突变 yycH 基因，分别克隆到 pLI50 中，将互补质粒 pLI50 - yycH 和 pLI50 - myycH 电转化到 29213ΔyycH 中。

结果

1. 体外选择突变体的抗菌耐药性：三株金黄色葡萄球菌 ATCC 25923、ATCC 29213 和 ATCC 43300 在 16 天内替加环素 MIC 升高到 16 mg/L，经 10 天瓶颈期后，MIC 进一步升高到 64 和 128 mg/L。将替加环素 MIC≤16 mg/L 的菌株定义为低水平耐药菌株，大于 16 mg/L 的为高水平 TRSAms。所有替加环素 MIC≥32 mg/L 的 TRSAms 对其他早期四环素类药物均呈现交叉耐药，且耐药水平与替加环素相似；MRSA ATCC 43300 突变体对 β - 内酰胺类药物表现出交叉敏感性。
2. mepA 表达随替加环素耐药性发展而增加：RT - qPCR 检测显示，在替加环素 MIC 大于 32 mg/L 的突变体中，三系金黄色葡萄球菌的外排泵基因 mepA 均持续过表达。在 EPIs 存在的情况下，对替加环素的 MIC 降低 2 - 16 倍稀释度，其中 RS 的外排抑制作用弱于 CCCP 和 NMP。表明 mepA 基因的显著过表达在 ALE 过程中赋予了替加环素耐药性。
3. 替加环素耐药突变体的适应性代价：选择每个系列亲本菌株的 5 个菌株评估适应性代价，低水平 TRSAms 除 ATCC 43300 谱系外，与亲本菌株在生长速率上无统计学差异，而所有高水平 TRSAms（MIC = 128 mg/L）生长速率均比其他菌株慢。所有 TRSAms 自溶活性均显著强于亲本菌株，但低水平和高水平菌株之间无显著差异。最高水平 TRSAms 的突变频率比亲本菌株增加 10 倍。总体而言，TRSAms 在高水平耐药时生长受限，自溶活性减弱，不同谱系的金黄色葡萄球菌在降低对替加环素敏感性的同时降低了基因组稳定性。
4. 替加环素耐药突变体的毒力减弱：高水平 TRSAm 菌株（MIC = 128 mg/L）的溶血活性较低于低水平菌株，体内感染大蜡螟模型显示，感染高水平 TRSAms 的大蜡螟存活率显著高于感染亲本菌株的大蜡螟，当亲本菌株感染导致大蜡螟死亡时，高水平感染组超过一半存活。
5. 体外选择突变体的基因逐步变化：对三株高水平 TRSAm 菌株进行 WGS 分析并用 Sanger 测序确认相关基因核苷酸序列。发现三个亲本菌株谱系中均同时检测到 yycH 和 fakA 基因的同步突变，且此类突变仅在高水平 TRSAms 中出现。氨基酸突变由相同的核苷酸替换（G > T）导致，FakA 中 Glu242 变为终止密码子，可能使 Met243 替换为起始密码子；YycH 中 Glu283Ter 导致 8 个氨基酸缺失（Glu283_Lys290del）。同时，在三个亲本菌株谱系中还依次鉴定出 mepA 和 rpsJ 基因的突变，rpsJ 基因发生同步突变（Lys57Gln 和 Asp60Tyr），mepA 基因在 ATCC 29213 和 ATCC 25923 谱系中同时检测到 Thr29Ile 和 Glu287Gly 突变，在 ATCC 43300 谱系中仅观察到 Glu287Gly 突变。
6. yycH 而非 fakA 参与维持替加环素敏感性：将 yycH 和 fakA 基因分别克隆到穿梭载体 pLI50 中，得到 pLI50 - yycH 和 pLI50 - fakA 并电转化到高水平 TRSAms 中。RT - qPCR 检测显示，电转化子中 yycH 转录水平与亲本菌株相当。pLI50 - yycH 电转化到高水平 TRSAm 菌株后，替加环素敏感性恢复到 16 - 32 mg/L，且仍存在外排抑制作用；而 pLI50 - fakA 电转化的 TRSAms 未恢复替加环素敏感性。进一步在金黄色葡萄球菌 ATCC 29213 中删除 yycH 基因，其四环素 MIC 未发生变化；在互补实验中，只有携带 Glu283Ter YycH 的互补菌株四环素 MIC 显著增加（0.125 - 2 mg/L，16 倍变化）。
7. 相关基因突变的临床相关性：将 rpsJ 基因克隆到 pLI50 中构建点突变质粒，携带 pLI50 - rpsJ 的金黄色葡萄球菌 RN4220 电转化子对四环素类药物 MIC 无变化，而点突变质粒使电转化子获得四环素耐药性，单点突变对替加环素 MIC 比 RN4220 增加 8 倍（0.125 - 1 mg/L），K57Q + D60Y 突变使 MIC 增加 16 倍（0.125 - 2 mg/L）。扫描全球基因组发现，2003 - 2019 年不同国家的 33 个来自人类、实验室和动物的基因组中存在与本研究相同的 rpsJ 基因突变，系统发育分析表明该突变与 2003 - 2016 年美国 MRSA ST5 - t002 的流行有关，而本研究中鉴定的 mepA 或 yycH 匹配突变未在全球基因组中发现。

讨论

本研究使用三株亲本金黄色葡萄球菌进行 ALE，虽菌株分属不同进化谱系，但在 ALE 过程中对替加环素敏感性降低的情况无差异。mepA 过表达是金黄色葡萄球菌对替加环素耐药的重要因素，但高水平 TRSAms 的选择并非仅依赖其过表达，且高水平 TRSAms 除了外排活性外还存在未知耐药机制。

此前研究未获得替加环素 MIC 大于 16 mg/L 的选择突变体，本研究获得了更高耐药水平的菌株，并通过表型评估提供了更全面的 ALE 轨迹。高水平 TRSAms 存在显著适应性代价，其自溶活性与替加环素耐药发生有关，且突变频率随替加环素敏感性降低而增加。毒力评估显示，菌株毒力与替加环素耐药性呈负相关，低水平和高水平 TRSAms 之间差异显著。

通过 WGS 和 SNV 分析发现，高水平 TRSAms 中存在 yycH 和 fakA 基因同步突变。虽 fakA 基因功能尚未明确，但 yycH 基因作为 WalRK 辅助蛋白，参与细胞壁代谢调节。本研究证实只有 yycH 基因与替加环素耐药有关，Glu283Ter 突变的 YycH 可降低金黄色葡萄球菌对替加环素的敏感性。

目前金黄色葡萄球菌对替加环素的耐药机制主要包括靶点改变和外排活性，而 Glu283Ter YycH 介导的耐药机制与已知机制不同。推测其可能通过直接阻碍替加环素跨细胞质膜渗透或调节其他途径减少药物摄取，也可能通过改变与替加环素的结合亲和力或重定向代谢途径减弱药物作用。

扫描全球基因组发现，rpsJ 基因突变在金黄色葡萄球菌分离株中已广泛存在，可导致对不同四环素类药物的交叉耐药。虽未发现 mepA 和 yycH 相同突变，但二者在临床耐药研究中具有重要意义，mepA 突变可作为分子监测靶点，yycH 蛋白可作为革兰氏阳性菌潜在耐药机制和抗菌靶点。

结论

本研究描绘了金黄色葡萄球菌在替加环素选择压力下 ALE 的完整进化轨迹，获得了高水平 TRSAm 菌株，通过表型分析揭示了高水平 TRSAms 的不同特征，基因组分析发现 yycH 和 fakA 基因同步突变，证实 yycH 基因参与金黄色葡萄球菌对替加环素的敏感性调节。为理解替加环素耐药机制和寻找潜在抗菌靶点提供了更全面的依据，但本研究未明确自溶减少与替加环素治疗的关系，未来可通过转录组分析进一步探究 yycH 基因突变影响替加环素敏感性的分子机制。