Activity-dependent regulation of Cdc42 by Ephexin5 drives synapse growth and stabilization：探索神经元可塑性调控新机制

为解决 Ephexin5（E5）在神经元可塑性调节中作用机制不明的问题，研究人员开展了 E5 对 Cdc42 和 RhoA 调控作用及相关机制的研究。结果表明 E5 可激活 Cdc42 和 RhoA，且其底物选择性受神经元活动和酪氨酸磷酸化调控，该研究为相关疾病治疗提供新思路。

　　大脑中的神经元就像一个个精密的 “信息处理器”，它们通过突触进行交流，而突触的正常发育和功能维持对于学习和记忆至关重要。在这个微观的神经世界里，Rho 鸟苷三磷酸酶（GTPase）家族及其调节因子发挥着关键作用。其中，Ephexin5（E5）作为一种 Rho GTPase 鸟嘌呤核苷酸交换因子（RhoGEF），以往研究认为它主要是 RhoA 特异性的 GEF，在大脑中参与调节突触密度，且与阿尔茨海默病、Angelman 综合征等疾病相关。然而，E5 在神经元可塑性调节中的具体作用机制仍存在诸多谜团，比如它如何在不同生理条件下对突触产生不同影响，以及其对不同 GTPase 的调控是否存在差异等，这些问题亟待解决。

为了揭开这些谜团，来自国外的研究人员开展了一系列深入研究。他们的研究聚焦于 E5 对 Cdc42 和 RhoA 的调控作用及其相关机制，旨在明确 E5 在神经元可塑性中的具体角色。研究结果发表在《SCIENCE ADVANCES》上，为理解神经元可塑性的调控机制提供了重要依据。

在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先，通过活性 GTPase 下拉实验，测定 E5 基因敲除（E5KO）和野生型（WT）小鼠全脑的活性 RhoA 和 Cdc42 水平，以此判断 E5 对这两种 GTPase 的调控作用。其次，利用基于荧光共振能量转移（FRET）的 GTPase 生物传感器进行活细胞成像，结合双光子谷氨酸去笼化技术，监测单个突触处的 Cdc42 和 RhoA 信号，探究 E5 在神经元活动诱导的可塑性过程中对底物的选择性。此外，还通过免疫沉淀、免疫印迹等技术，分析 E5 的酪氨酸磷酸化水平变化以及其与神经元活动的关系 。

下面来具体看看研究的结果：

• E5 调控大脑中 Cdc42 和 RhoA 的激活：研究人员通过活性 GTPase 下拉实验测量 E5KO 和 WT 小鼠全脑的活性 RhoA 和 Cdc42 水平。结果发现，与 WT 小鼠相比，E5KO 小鼠大脑中活性 RhoA 和 Cdc42 水平均显著降低，这表明 E5 在大脑中对 RhoA 和 Cdc42 的激活都起到调节作用。
• E5 在神经元可塑性中对 Cdc42 信号的调控具有选择性：利用 FRET 生物传感器和双光子谷氨酸去笼化技术，研究人员在活神经元中监测 E5 对 Cdc42 和 RhoA 信号的调控。实验结果显示，在诱导长期可塑性的过程中，高频谷氨酸去笼化（HFU）刺激能显著激活 WT 神经元中靶向棘突的 Cdc42，但 E5KO 神经元中 Cdc42 的峰值激活明显降低；而对于 RhoA，HFU 诱导的激活在 E5KO 和 WT 神经元中没有差异。这说明 E5 在神经元可塑性过程中，对 Cdc42 信号的调控具有选择性，主要促进 Cdc42 信号传导，而非 RhoA。
• E5 的酪氨酸磷酸化受发育和神经元活动调控：研究人员通过免疫沉淀和免疫印迹技术，检测不同发育阶段小鼠大脑以及化学诱导长时程增强（cLTP）处理后的急性脑片中 E5 的酪氨酸磷酸化水平。结果发现，随着小鼠大脑发育，从出生后第 7 天（P7）到第 19 天（P19），E5 的酪氨酸磷酸化水平显著降低；在 cLTP 处理后，E5 的酪氨酸磷酸化水平也明显下降，且这种下降不是由于蛋白质降解，而是依赖于去磷酸化过程。这表明 E5 的酪氨酸磷酸化受发育和神经元活动的调控。
• E5 Y361F 突变增强神经元中 Cdc42 的激活：研究人员构建了 E5 Y361F 突变体（E5^Y361F），并在神经元中表达。通过 FRET 生物传感器测量 Cdc42 和 RhoA 的活性，发现表达 E5^Y361F的 E5KO 神经元中 Cdc42 活性显著升高，而 RhoA 活性不受影响。这说明 E5 在 Y361 位点的去磷酸化能选择性增强 Cdc42 的激活。
• E5 的 GEF 活性对活动依赖性长时程棘突生长和 Cdc42 信号传导至关重要：研究人员对 GFP 转染的 E5KO 和 WT 神经元进行 LTP 诱导的 HFU 刺激，监测棘突大小变化。结果显示，E5KO 神经元的棘突在 HFU 刺激后无法实现持续生长，而 WT 神经元的棘突则能显著生长。进一步研究发现，表达 E5^WT能挽救 E5KO 神经元棘突生长缺陷，而表达 GEF 失活的 E5 突变体（E5^LQR）则不能；同时，E5^LQR表达的 E5KO 神经元中，HFU 诱导的 Cdc42 激活明显降低。这表明 E5 的 GEF 活性对于活动依赖性长时程棘突生长和 Cdc42 信号传导是必需的。
• E5^Y361F突变体可挽救 E5KO 神经元中活动依赖性棘突生长和 Cdc42 信号传导：研究人员刺激共表达 eGFP 和 E5^WT或 E5^Y361F的 E5KO 神经元的单个树突棘，发现表达 E5^Y361F的 E5KO 神经元的 HFU 诱导的长时程棘突生长与表达 E5^WT的神经元无显著差异，且能挽救 Cdc42 信号传导。这表明 E5^Y361F突变体可有效挽救 E5KO 神经元中活动依赖性棘突生长和 Cdc42 信号传导。

综合上述研究结果，研究人员得出结论：E5 在神经元中能够调节 Cdc42 和 RhoA 的激活，且在神经元活动依赖性的可塑性过程中，其底物选择性偏向于 Cdc42。神经元活动通过调节 E5 的酪氨酸磷酸化来改变其底物选择性，去磷酸化的 E5 优先激活 Cdc42，进而促进突触生长和稳定，这对于学习过程中神经元可塑性的调节至关重要。

该研究具有重要意义。一方面，它揭示了 E5 在神经元可塑性调节中的新机制，为理解大脑学习和记忆的分子基础提供了新的视角；另一方面，鉴于 E5 与阿尔茨海默病、Angelman 综合征等疾病的相关性，研究结果为这些疾病的治疗提供了潜在的干预靶点和理论依据，有望推动相关疾病治疗策略的开发和改进。