豆蔻与顺铂协同抗骨肉瘤：mTOR 介导自噬的新突破

《Cancer Gene Therapy》：Cardamom synergizes with cisplatin against human osteosarcoma cells by mTOR-mediated autophagy

骨肉瘤（OS）治疗中，顺铂（DDP）单药疗效不佳且副作用大。为解决此问题，研究人员开展了豆蔻（CAR）与 DDP 联合治疗 OS 的研究。结果显示，二者联合可协同抑制 OS 细胞生长，机制与 mTOR 介导的自噬有关，这为 OS 治疗提供了新策略。

　　在青少年群体中，骨肉瘤（Osteosarcoma，OS）是一种极为常见的恶性骨肿瘤，如同潜藏在身体里的 “定时炸弹”，时刻威胁着患者的生命健康。它具有极强的增殖和侵袭能力，使得患者的复发率居高不下，长期生存率也相对较低。目前，手术和化疗是治疗 OS 的主要手段，其中顺铂（Cisplatin，DDP）作为一线化疗药物被广泛应用。然而，DDP 单药治疗效果往往差强人意，尤其是对于存在远处转移或耐药的患者，治疗结果常常令人沮丧。而且，接受 DDP 治疗的患者不可避免地会遭受严重的毒副作用，这无疑让患者的治疗之路雪上加霜。因此，寻找能够增强 DDP 疗效、降低其副作用的方法迫在眉睫。

在此背景下，重庆大学附属沙坪坝医院、重庆医科大学等机构的研究人员开展了一项关于豆蔻（Cardamom，CAR）与 DDP 联合治疗 OS 的研究。该研究成果发表在《Cancer Gene Therapy》上，为 OS 的治疗带来了新的希望。

研究人员为了探究 CAR 与 DDP 联合治疗 OS 的效果及潜在机制，运用了多种技术方法。在细胞实验方面，通过 MTT 法、EdU 法检测细胞活力和增殖情况；利用流式细胞术（Flow cytometry）分析细胞凋亡；借助 Western blot 技术检测相关蛋白表达水平。在动物实验方面，构建了 OS 肿瘤异种移植模型，对荷瘤小鼠进行分组给药处理，并通过免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）和苏木精 - 伊红染色（Hematoxylin-Eosin staining，H&E staining）对肿瘤组织进行分析。同时，运用网络药理学方法筛选潜在作用靶点，构建蛋白 - 蛋白相互作用网络（Protein-Protein Interaction Network，PPI 网络），以挖掘联合治疗的关键分子机制。

研究结果如下：

1. CAR/DDP 联合抑制 OS 细胞增殖：MTT 实验表明，CAR 和 DDP 对 143B 和 MG63 OS 细胞均有抑制作用。ZIP 模型分析显示，二者联合具有显著的协同效应，EdU 实验进一步证实了联合治疗组对细胞增殖的抑制率明显高于单药组。在体内实验中，OS 肿瘤异种移植模型显示，CAR/DDP 联合治疗组的肿瘤体积明显小于单药治疗组，且对肿瘤细胞的恶性表型抑制作用最强，这表明 CAR 与 DDP 联合能够有效抑制 OS 细胞在体内外的增殖。
2. CAR/DDP 联合抑制 OS 细胞中 mTOR 的激活：通过网络药理学分析，研究人员筛选出 mTOR 等可能是 CAR 和 DDP 作用于 OS 的关键靶点。实验结果显示，CAR、DDP 单独及联合处理均能降低 mTOR 在 Ser²⁴⁴⁸位点的磷酸化水平，且联合治疗组下降最为显著。IHC 结果也进一步证实了这一点，表明 CAR/DDP 联合可能通过抑制 mTOR 的激活来发挥抗 OS 作用。
3. CAR/DDP 联合通过失活 mTOR 促进自噬：mTOR 是调节自噬的关键分子，其激活可抑制自噬。研究发现，CAR/DDP 联合处理后，OS 细胞中代表自噬体形成的 GFP puncta 增多，自噬体与溶酶体的共定位增加，LC3II/I 比值升高，Beclin-1、Atg5 和 Atg7 等自噬相关蛋白表达增加，同时 P62 蛋白水平降低而 mRNA 水平升高。此外，透射电镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）观察到联合治疗组细胞中自噬体积累增多，RFP-GFP-LC3 双荧光标记腺病毒监测显示自噬通量增强。而 mTOR 激活剂 MHY 和自噬抑制剂羟氯喹（Hydroxychloroquine，HCQ）能够抑制 CAR/DDP 联合诱导的自噬，这表明 CAR/DDP 联合可通过失活 mTOR 促进 OS 细胞自噬。
4. CAR/DDP 联合诱导 OS 细胞凋亡：Hoechst 染色和流式细胞术分析表明，CAR/DDP 联合处理的 OS 细胞凋亡水平明显高于单药组。Western blot 结果显示，联合治疗组促凋亡蛋白 Cleaved-Caspase3、Cleaved-Parp、Cleaved-Caspase9、Bax 和 Bad 表达增加，而抗凋亡蛋白 Bcl2 表达减少。IHC 结果也证实了联合治疗对肿瘤组织中 Bcl2 蛋白的抑制作用，说明 CAR/DDP 联合可诱导更多的 OS 细胞凋亡。
5. CAR/DDP 联合诱导的凋亡与自噬相关：Hoechst33258 染色和 MTT 实验表明，自噬抑制剂 HCQ 和 mTOR 激活剂 MHY 能够抑制 CAR/DDP 联合诱导的细胞凋亡，并部分恢复细胞活力。Western blot 结果显示，二者可逆转联合治疗引起的 Cleaved-Caspase3 水平升高和 Bcl2 水平降低，这表明 CAR/DDP 联合诱导的凋亡可能与自噬密切相关。
6. CAR 通过增强自噬减轻 DDP 耐药性：在 OS 细胞和 DDP 耐药细胞系（HOS/DDP）中进行的实验表明，CAR 能够在一定程度上降低 DDP 耐药性，且 HCQ 可部分抑制这种作用，说明 CAR 减轻 DDP 耐药性可能与增强自噬有关。

综上所述，该研究证实了 CAR 能够显著增强 DDP 对 OS 细胞生长的抑制作用，二者联合通过使 mTOR 失活诱导自噬，进而协同抑制 OS 细胞的增殖、促进细胞凋亡，并减轻 DDP 耐药性。这一研究成果为 OS 的临床治疗提供了新的联合治疗策略，为改善 OS 患者的预后带来了新的曙光。同时，该研究也为深入了解天然产物与化疗药物联合治疗肿瘤的机制提供了重要依据，有望推动相关领域的进一步研究和发展。