骨痂类器官研究：揭示骨修复机制差异及性别影响，助力个性化骨植入物研发

《Bone Research》：Callus organoids reveal distinct cartilage to bone transition mechanisms across donors and a role for biological sex

为解决组织工程化先进治疗药物临床转化缺乏患者相关及过程中生物学质量控制，以及对供体变异性和生物性别影响骨修复机制认识不足的问题，研究人员开展骨形成与非骨形成类器官对比研究，发现供体差异和生物性别影响骨修复路径，分泌蛋白质组或为生物标志物，有助于推动骨组织工程发展。

　　在骨骼组织工程领域，虽然它不断发展，但距离满足人们的高期望仍有差距。目前，基于细胞的骨骼组织工程策略成功转化到临床应用的案例较少，主要原因在于规模扩大和制造方面存在挑战，而且缺乏能够预测植入物再生能力和效力的可靠质量控制方法，也缺少能反映生物变异性且可无创测量的指标。同时，在骨修复过程中，尽管对一些全身因素如免疫细胞活性、生物性别和年龄等在早期炎症阶段和后期重塑阶段的作用有所研究，但对于影响软骨痂组成和动力学的因素却知之甚少。此外，在开发个性化骨植入物时，必须全面了解生物变异，并将其与可测量的效力测定以及体内结果相联系，然而目前尚未找到能普遍反映组织工程产品软骨分化过程且与体内效力有预测性关联的标志物。在这样的背景下，为了解决上述问题，来自比利时鲁汶大学（KU Leuven）等机构的研究人员开展了相关研究。
研究人员利用人骨膜来源的细胞（hPDCs）构建骨痂类器官，通过一系列正交质量表征研究，包括组织学分析、转录组分析和分泌蛋白质组分析，探究了细胞身份、细胞外基质组成和旁分泌信号在软骨向骨转化中的作用。
研究结果如下：

1. 骨痂类器官作为发育组织工程的构建模块：hPDCs 在非粘附微孔平台上通过重力作用自发聚集，形成早期骨痂类器官，经 21 天软骨分化后，收集 600 个类器官在琼脂糖模具中形成组装体，再在软骨形成培养基中培养 24 小时，使其融合成软骨植入物，然后植入裸鼠体内进行体内评估。
2. 早期增殖决定骨痂类器官大小动力学和形态：通过时间推移明场成像观察到，在软骨分化过程中，不同供体来源的骨痂类器官呈现出两种不同的形态，男性和女性来源的类器官在大小变化、细胞数量增加等方面存在差异，但分泌的可溶性蛋白量相似。
3. 骨痂类器官显示供体依赖的肥大软骨或纤维软骨表型：对 10 名供体来源的骨痂类器官进行组织学分析，发现存在两种不同的表型，一种是肥大软骨（HyC）表型，表现为大量细胞外基质（ECM）、硫酸化糖胺聚糖（sGAGs）、胶原蛋白 II（Col II）、印度刺猬蛋白（Ihh）和 osterix（Osx）阳性；另一种是纤维软骨（FiC）表型，虽有软骨分化和 ECM 沉积迹象，但 ECM 体积、成熟度和肥大细胞形态不足。
4. 转录组分析揭示骨痂类器官之间的共同软骨形成特征：对分化 21 天的类器官进行转录组分析，发现不同类型的类器官存在明显的转录聚类，同时确定了与骨骼系统发育、ECM 组织、转化生长因子 -β（TGF-β）信号通路等相关的基因。
5. 骨痂类器官分泌蛋白质组分析揭示特定的生物标志物候选物：对类器官的条件培养基进行蛋白质组分析，鉴定出不同类型类器官分泌的特异性蛋白质，以及与软骨向骨转化相关的共同分泌蛋白质，这些蛋白质与 ECM 修饰、细胞迁移、免疫细胞激活和血管生成有关。
6. 两组骨痂组装体植入物在植入后均可形成骨小体：将供体特异性组装体植入裸鼠皮下 4 周后，发现两种软骨亚型都能发生软骨向骨的转化，但存在供体特异性差异，且 HyC 途径的植入物在产生高质量骨组织方面效率更高。
   研究结论表明，工程化人骨膜来源的骨痂类器官是用于修复骨缺损的组织工程化先进治疗药物（ATMPs）自下而上生物制造的有前途的构建模块。该研究揭示了生物性别在骨膜骨修复机制中的作用，以及骨折痂的纤维化成分和骨膜祖细胞群体的潜在异质性，这些因素导致了不同的痂表型和软骨向骨转化途径。同时，研究还发现了与特定分泌蛋白质组相关的功能稳健性，这些分泌蛋白质组是有前途的可测量生物标志物候选来源，可用于质量监测和效力预测。然而，该研究也存在一些局限性，如使用免疫缺陷雌性小鼠的异位骨形成模型，无法充分了解免疫系统的作用，且未研究起始细胞群体或最终植入物细胞内容的异质性。未来需要在更广泛的生物变异性、免疫健全的大型动物模型以及与临床前或临床使用的最终制造协议的相互作用等方面对已鉴定的分泌蛋白质组进行定量验证，以定义预测性关键质量属性。总之，这项研究为骨组织工程的发展提供了重要的理论依据和实践指导，有望推动个性化骨植入物的临床应用。
   研究人员开展研究时用到的主要关键技术方法包括：从 12 名人类供体获取 hPDCs 并进行培养；利用微 CT 对矿化组织进行 3D 量化；通过转录组分析，包括文库制备、测序、质量控制、比对和差异表达分析等步骤研究基因表达情况；采用蛋白质组分析，对蛋白质进行沉淀、分离、质谱分析和数据处理以鉴定蛋白质 。