ACVR2A 失活促肝癌免疫逃逸新机制：靶向干预或破免疫治疗困境

《Cell Reports Medicine》：ACVR2A attenuation impacts lactate production and hyperglycolytic conditions attracting regulatory T cells in hepatocellular carcinoma

本文聚焦肝细胞癌（HCC），发现 ACVR2A 失活通过激活 SMAD 信号通路，促进癌细胞糖酵解产乳酸，招募调节性 T 细胞（Treg），导致免疫逃逸和免疫治疗耐药。抑制 MCT4 可改善这一情况，为 HCC 免疫治疗提供新思路。

　　

研究背景

肝细胞癌（HCC）是原发性肝癌的主要类型，多种因素如乙肝病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）感染、酒精滥用和代谢综合征等会增加患病风险。此前研究已发现 Wnt/β - catenin、Notch、PI3K/AKT/mTOR 和转化生长因子 β/SMAD 等信号通路在 HCC 发生发展中起重要作用。近年来，代谢相关肝癌和免疫检查点抑制剂免疫疗法的出现，引发了对 HCC 分子机制和治疗策略的广泛讨论。

ACVR2A 编码激活素 A 受体 2A 型，在非酒精性脂肪性肝炎相关 HCC（NASH - HCC）中频繁突变，且与抗 PD - 1 治疗耐药有关，但 ACVR2A 在 HCC 中的详细分子机制和生物学功能尚未完全阐明。本研究旨在探究 ACVR2A 失活在 HCC 中的作用机制，为治疗提供新策略。

研究方法

1. 细胞和动物模型：构建人源和小鼠源 HCC 细胞系的 ACVR2A 基因敲除（KO）细胞，包括 HuH7、PLC/PRF/5、Hepa1 - 6 和 3H3 - Pten - KO 细胞。使用 C57BL/6 和 KSN 裸鼠建立皮下和原位移植瘤模型。
2. 实验分组：将细胞或小鼠分为对照组（NC）和 ACVR2A - KO 组，部分实验进一步设置干预组，如使用 MCT4 抑制剂 VB124、抗 PD - 1 抗体、抗 CTLA - 4 抗体、抗 CD25 抗体处理等。
3. 检测指标与方法
   • 基因和蛋白水平检测：运用 RNA 测序（RNA - seq）、定量逆转录 PCR（RT - PCR）、蛋白质免疫印迹（Western blot）、染色质免疫沉淀（ChIP）、免疫共沉淀（Co - IP）等技术，检测相关基因和蛋白的表达、修饰及相互作用。
   • 细胞功能检测：采用增殖、伤口愈合、迁移、侵袭、集落形成和球体形成实验，评估细胞的恶性表型。
   • 代谢产物检测：测量细胞内外乳酸和葡萄糖浓度，评估代谢变化。
   • 免疫细胞分析：通过组织病理学评估、流式细胞术分析肿瘤浸润淋巴细胞，检测免疫细胞的数量和功能变化。
   • 生物信息学分析：利用 The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库和其他公开数据集，进行基因变异、生存分析和单细胞 RNA 测序（scRNA - seq）数据分析。

研究结果

1. ACVR2A 失活对 HCC 患者预后和细胞生物学功能的影响
   • 通过分析 TCGA 数据库中 371 例 HCC 患者的基因组和临床数据，发现 ACVR2A 在非病毒性 HCC 中特异性突变，且低表达与患者预后不良相关。在东京医科齿科大学医院的 183 例临床样本中也得到了类似结果。
   • ACVR2A 基因沉默增强了 HCC 细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成能力。CRISPR - Cas9 系统构建的 HuH7 和 Hepa1 - 6 细胞的 ACVR2A - KO 细胞，恶性表型显著增强。
2. ACVR2A 失活诱导 HCC 细胞糖酵解和乳酸产生
   • RNA - seq 分析显示，Hepa1 - 6 NC 和 KO 细胞相比，ACVR2A KO 与糖酵解、缺氧和血管生成增强显著相关。基因本体（GO）富集分析表明，差异表达基因显著富集于糖酵解相关生物学过程。
   • RT - PCR 和 Western blot 分析证实，ACVR2A - KO 细胞中糖酵解相关基因（如 LDHA、GAPDH、ALDOA 等）和蛋白（如 HIF1α、LDHA、VEGFA）表达上调。ACVR2A - KO 细胞的细胞内外乳酸浓度升高，葡萄糖浓度降低。
3. ACVR2A 失活构建免疫抑制性肿瘤微环境
   • 皮下注射 HuH7 KO 和 Hepa1 - 6 KO 细胞的免疫缺陷小鼠，肿瘤体积显著增大。肿瘤组织中 LDHA 表达升高，CD31 阳性内皮细胞增多，提示糖酵解和血管生成信号通路激活。
   • 组织病理学评估发现，ACVR2A - KO 肿瘤组织中 iNOS 阳性 M1 巨噬细胞减少，arginase - 1 阳性 M2 巨噬细胞增加。同时，CD8⁺ T 细胞浸润减少，Foxp - 3⁺ Treg 细胞富集，CD8/Foxp - 3 比值降低。
   • 体内实验表明，使用抗 CD25 抗体消耗 Treg 细胞，可抑制 Hepa1 - 6 KO 细胞的肿瘤生长。在原位移植瘤模型中，也观察到类似的结果，且 KO 肿瘤组织的乳酸浓度显著高于 NC 肿瘤组织和正常肝组织。
4. ACVR2A 低表达 HCC 的组织病理学评估
   • 对人 HCC 临床样本进行免疫组织化学分析，发现 ACVR2A 低表达组与代谢功能障碍相关的脂肪性肝病 / 代谢功能障碍相关的脂肪性肝炎（MASLD/MASH）、高酒精消耗和无病毒感染密切相关，且总体生存率（OS）较差。
   • 免疫组织化学染色显示，ACVR2A 低表达的 HCC 细胞中 LDHA 表达增强，CD8⁺ T 细胞数量减少，Foxp - 3⁺ Treg 细胞数量增加。通过公开数据集的综合分子和免疫分析，进一步证实了 ACVR2A 缺陷、高糖酵解和 Treg 细胞浸润之间的关系。
5. LDHA 表达受激活素 / SMAD 信号通路调控
   • 研究发现，HIF1A 基因敲除对 ACVR2A - KO 细胞中 LDHA 表达影响较小，提示存在 HIF1α 非依赖的分子机制。
   • 使用短发夹 RNA（shRNA）靶向 ACVR2A - KO 细胞中的 LDHA，可下调 HIF1α 蛋白水平。免疫沉淀分析表明，ACVR2A - KO 细胞中 HIF1α 的乳酸化水平增加。
   • LDHA 基因敲低抑制了 ACVR2A - KO 细胞的增殖、克隆形成能力，降低了细胞内外乳酸浓度，抑制了肿瘤生长，并改变了肿瘤组织中免疫细胞的浸润。
   • ACVR2A KO 导致 SMAD2 和 SMAD3 磷酸化以及 SMAD4 核转位受抑制，ChIP 分析显示 SMAD4 在 LDHA 启动子区域的结合减少。
6. MCT 抑制降低肿瘤内乳酸浓度并减弱 Treg 细胞诱导
   • Western blot 分析显示，ACVR2A - KO 细胞中 MCT4 表达上调。MCT4 抑制剂 VB124 处理可抑制 HuH7 KO 和 Hepa1 - 6 KO 细胞的增殖和克隆形成能力，降低细胞外乳酸浓度。
   • 共培养实验表明，KD of LDHA 和使用 MCT1 抑制剂 AR - C155858、MCT4 抑制剂 VB124 处理，显著减少了 Foxp - 3⁺ Treg 细胞的比例。过表达 Ldha 和 Mct4 则增加了细胞外乳酸浓度和 Treg 细胞数量。
   • 研究还发现，MCT4 在 HCC 细胞的乳酸转运中起关键作用，KD of Mct1 对细胞外乳酸浓度和 Foxp - 3⁺ Treg 细胞比例无显著影响。
7. MCT4 抑制增强抗 PD - 1 抗体治疗效果
   • 给荷瘤小鼠腹腔注射抗 PD - 1 抗体，Hepa1 - 6 NC 细胞的肿瘤体积减小，但 Hepa1 - 6 KO 肿瘤对治疗无明显反应。免疫染色显示，抗 PD - 1 抗体处理后，NC 和 KO 肿瘤中 CD8⁺ T 细胞和 Foxp - 3⁺ Treg 细胞浸润均增加，但仅在 NC 肿瘤中 CD8/Foxp - 3 比值显著上调。
   • 建立 HuH7 KO 和 Hepa1 - 6 KO 细胞的四环素诱导型 shMCT4 细胞系，MCT4 基因敲低抑制了肿瘤生长，恢复了对抗 PD - 1 治疗的敏感性。使用 MCT4 抑制剂 VB124 联合抗 PD - 1 抗体治疗，显著增强了对 Hepa1 - 6 KO 和 3H3 - Pten - KO 细胞来源肿瘤的抑制作用，上调了 CD8/Foxp - 3 比值，激活了 CD8⁺ T 细胞。
   • 对接受 18F - 氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描 - 计算机断层扫描（FDG - PET/CT）的 HCC 患者样本进行免疫染色，发现 FDG - PET 高摄取与 LDHA 表达增加和 Treg 细胞招募增强显著相关。

研究结论

本研究通过基因工程小鼠模型和临床样本研究发现，ACVR2A 失活在非病毒性 HCC 中普遍存在，其通过激活素 / SMAD/LDHA 轴诱导乳酸产生和分泌。高乳酸环境促进 Treg 细胞介导的免疫逃逸，导致对传统免疫治疗的耐药。抑制 MCT4 可改善肿瘤微环境，增强免疫治疗效果，为 ACVR2A 缺陷和 Treg 细胞丰富的 HCC 治疗提供了新的潜在策略。然而，本研究存在一定局限性，如 MCT4 抑制剂的临床疗效和安全性尚未明确，FDG - PET 病例样本量小，转录组数据集和 scRNA - seq 存在技术局限性等，未来需进一步研究。