Single-cut 基因疗法：在恒河猴杜氏肌营养不良模型中的重大突破

《Cell Reports Medicine》：Single-cut gene therapy in a one-step generated rhesus monkey model of Duchenne muscular dystrophy

杜氏肌营养不良（DMD）是一种严重的 X 连锁遗传疾病，目前治疗手段有限。本文通过优化非人灵长类 DMD 模型的构建，开发出 Single-cut 基因疗法。该疗法能恢复 dystrophin 蛋白表达，改善肌肉病理和运动功能，且长期有效、安全性高，为 DMD 治疗带来新希望。

　　### 研究背景
杜氏肌营养不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一种严重的 X 连锁遗传疾病，由 DMD 基因突变导致 dystrophin 蛋白缺失或功能异常，进而引发肌肉进行性无力和退化。全球每 3500 - 5000 名男孩中约有 1 人患病，目前仍无法治愈。

现有的治疗方法，如皮质类固醇虽能延缓疾病进展，但存在严重的长期副作用；反义寡核苷酸外显子跳跃疗法需要每周给药，疗效有限；Mini/micro - dystrophin 疗法则面临免疫反应和功能域缺失等问题。基因编辑技术为 DMD 的治疗带来了希望，其中 CRISPR 编辑系统在多种 DMD 动物模型中成功恢复了 dystrophin 表达，但仍面临基因编辑效率、系统递送、脱靶效应、免疫反应以及长期安全性和有效性等挑战。

大型哺乳动物由于其生理和解剖结构与人类相似，在将临床前研究成果转化为人体试验方面具有重要价值。此前的大型哺乳动物 DMD 模型，如猪和狗，虽有助于理解 CRISPR 的潜力，但在模拟人类疾病的复杂性方面存在局限性。非人灵长类（NHP）与人类在遗传和生理上更为相似，是更具临床相关性的模型。本研究旨在构建快速生成的 DMD 恒河猴模型，并利用该模型开发一种适用于人类的单切割基因治疗策略。

研究结果

1. 一步生成具有外显子 50 突变的 DMD 恒河猴模型
   外显子 50 是 DMD 基因的关键突变热点，其缺失或突变会导致外显子 51 出现提前终止密码子，产生截短且无功能的 dystrophin 蛋白。研究人员设计了 5 种靶向该外显子剪接供体部位的单向导 RNA（sgRNAs），通过 Cas9 切割实验筛选出切割效率较高的 sgRNA2。利用显微注射技术，将 Cas9 mRNA 和 sgRNA2 注入受精后的猴卵母细胞中，经胚胎培养和移植，成功获得了携带外显子 50 突变的 DMD 恒河猴模型。
   对出生后的猴子进行肌肉活检，在 DNA、RNA 和蛋白质水平的分析表明，突变猴子的外显子 50 发生了多种突变，导致外显子 51 出现提前终止密码子，dystrophin 蛋白表达缺失。对流产胎儿的多组织检测以及对不同年龄猴子的研究进一步证实，该模型在肌肉组织中呈现出与人类 DMD 相似的病理特征，如肌肉纤维直径变化、中央核增多、肌肉纤维化等，同时伴有肌酸激酶（CK）等生化指标升高。
2. DMD^Ex50猴模型表现出营养不良性肌肉病理和运动功能受损
   对 DMD^Ex50猴模型的肌肉病理和运动功能进行深入研究发现，其肌肉组织经 H&E 和天狼星红染色后，呈现出典型的肌肉营养不良病理特征，包括肌肉纤维直径差异大、排列松散、中央核百分比显著增加以及肌肉纤维化。从 3 个月起，模型猴子的 CK 水平持续升高，其他生化指标如天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、乳酸脱氢酶（LDH）和 α - 羟丁酸脱氢酶（α - HBDH）也高于年龄匹配的对照组。此外，DMD^Ex50猴子的体重在 11 - 36 个月期间低于野生型（WT）猴子。
   在运动功能方面，DMD^Ex50猴子表现出类似人类 DMD 患者的行走困难，如踮脚尖行走，足迹长度与脚长的比值明显降低。在 1 小时的活动记录中，其行走距离、行为总数以及垂直悬挂和站立相关行为的持续时间均显著减少，表明肌肉力量明显减弱。
3. 建立适用于人类的基因校正策略
   针对约 13% 的 DMD 患者，通过对 DMD 基因外显子 51 进行重编或跳跃有望改善病情。研究人员采用单切割基因修饰策略，在猴子 DMD 基因外显子 51 的 5′ - AG - 3′剪接受体位点诱导 DNA 双链断裂。设计了 4 种靶向该位点的 sgRNAs，在体外编辑实验中，sgRNA3 和 sgRNA4 表现出较高的有效编辑效率和总编辑效率。考虑到人类和猴子外显子 51 序列的高度同源性，选择编辑效率更高的 sgRNA3 进行后续研究。
   构建了由肌肉特异性腺相关病毒（MyoAAV）介导的单载体治疗系统 MyoAAV - Cas12i^Max - sgRNA3^Ex51，并在两只 WT 猴子的肱三头肌（TB）和腓肠肌（GM）进行局部注射，评估其编辑效率。结果显示，不同肌肉的编辑效率存在差异，且在 mRNA 水平的编辑效率高于 DNA 水平。这表明该治疗策略在猴子模型中具有可行性，为进一步在 DMD 猴子模型中开展研究奠定了基础。
4. 通过低剂量全身递送 MyoAAV - Cas12i^Max - sgRNA3^Ex51持续恢复 DMD^ΔEx50猴模型中的 dystrophin 蛋白表达
   对一只 17 个月大的 DMD^ΔEx50猴子（MT2）静脉注射 MyoAAV - Cas12i^Max - sgRNA3^Ex51，剂量为 4×10¹³ vg/kg，并在注射前后给予免疫抑制剂。在注射后的 8 周、35 周、1 年和 1.5 年进行肌肉活检。
   DNA 编辑效率在不同肌肉中有所不同，部分肌肉如 TB、BB 在特定时间点表现出相对较高的编辑效率。mRNA 水平的编辑效率在多个肌肉中也较高，且与 DNA 编辑效率的变化趋势基本一致。通过 Western blot 和免疫染色检测发现，治疗后多个肌肉组织中的 dystrophin 蛋白表达成功恢复，且在 1.5 年时，尽管部分肌肉在 DNA 和 RNA 水平检测不到编辑，但 dystrophin 蛋白仍可检测到。这表明该基因治疗方法能够有效恢复 dystrophin 蛋白表达，且具有一定的持续性。
5. 治疗后肌肉病理和运动功能的长期改善
   对治疗后的猴子进行肌肉病理和功能评估，H&E 和天狼星红染色结果显示，肌肉病理在治疗后 8 周开始显著改善，随着时间推移，35 周、1 年和 1.5 年时进一步好转，表现为炎症细胞浸润、坏死和纤维化减少，肌肉纤维结构恢复。
   在运动功能方面，通过对猴子进行不同体位下的站立能力测试发现，治疗后猴子的站立能力明显提高，尤其是在双手被绑在背后的仰卧和俯卧位时，站立成功率显著增加，这表明猴子的核心和腿部力量得到了增强。
   此外，免疫组化分析显示治疗后 CD4⁺和 CD8⁺ T 细胞水平无显著变化，生化指标也未出现明显改变，表明该基因治疗未引发明显的炎症反应和器官损伤。通过全基因组测序（WGS）和深度扩增子测序对潜在脱靶效应进行评估，结果显示脱靶效应极小，进一步证明了该基因编辑方法的特异性和安全性。

研究讨论

基因治疗 DMD 领域发展迅速，多种治疗策略在动物模型中显示出一定疗效，但由于 DMD 疾病本身的特点，需要全身递送治疗药物，这给治疗带来了诸多挑战，如剂量、疗效和安全性等问题。非人灵长类模型因其与人类的相似性，在评估治疗效果和安全性方面具有重要意义。

本研究成功构建了具有外显子 50 突变的 DMD 恒河猴模型，且模型构建时间从以往的 6 - 7 年缩短至不到 1 年。利用该模型开发的肌肉特异性单载体基因修复策略，在治疗后 8 周即观察到 dystrophin 蛋白的显著恢复，且未发现明显的不良事件、免疫反应和脱靶效应。长期随访结果表明，该治疗方法具有持续的疗效，能够改善肌肉病理和运动功能。
然而，研究也发现治疗反应在不同肌肉组之间存在差异，上肢肌肉如 TB 和 BB 的 dystrophin 恢复情况优于下肢肌肉。这可能与不同肌肉的基因编辑效率差异有关，提示在评估治疗效果时需要考虑肌肉组织的特异性。
总体而言，本研究开发了一种快速高效的 DMD 非人灵长类模型构建方法，并展示了一种具有临床应用潜力的基因治疗策略。该策略具有长期疗效和较低风险，为 DMD 患者实现持久安全的治疗迈出了关键一步。但由于本研究仅使用了一只 DMD 猴子进行基因治疗评估，后续还需要更多动物实验来进一步验证该结果。