插入缺失突变（Indels）：解锁抗病毒蛋白进化新潜能，突破错义突变限制

《Cell Genomics》：Indels allow antiviral proteins to evolve functional novelty inaccessible by missense mutations

在这场病毒与宿主的 “军备竞赛” 中，本文研究发现插入缺失突变（Indels）可让抗病毒蛋白 TRIM5α 获得新功能，克服错义突变难以应对的病毒挑战，揭示了 Indels 在抗病毒蛋白进化中的关键作用，为理解宿主抗病毒机制提供了新视角。

　　

研究背景

宿主基因组利用限制因子（具有直接抗病毒活性的先天免疫蛋白）抵御病毒感染。在病毒与宿主的进化军备竞赛中，限制因子在病毒结合界面处快速进化，以识别新病毒或逃避病毒编码拮抗剂的结合。错义突变在宿主 - 病毒进化及蛋白质进化研究中备受关注，但插入或缺失突变（Indels）对限制因子功能的影响尚未得到系统研究。本研究聚焦于人类 TRIM5α 蛋白，旨在比较错义突变与 Indels 赋予其功能新特性的能力。

研究方法

1. 构建突变体库：运用高通量饱和错义诱变技术，构建人类 TRIM5α 全长蛋白 v1 环所有可能的单错义变体深度突变扫描（DMS）文库；同时，构建涵盖 v1 环每个密码子 1 - 9 个氨基酸长度的框内缺失或序列重复的深度插入缺失扫描（DIS）文库。
2. 筛选与检测：将突变体库在缺乏 TRIM5α 的细胞中表达，用携带 GFP 的单周期猴免疫缺陷病毒（SIV_sab）感染细胞，通过荧光激活细胞分选（FACS）筛选出未被感染（GFP^neg）的细胞，并利用深度测序鉴定其中的 TRIM5α 变体，以变体在筛选池中的富集情况衡量其抗病毒功能。
3. 构建嵌合体及突变体：构建人源和恒河猴源 TRIM5α 的 v1 环互换嵌合体，以及在人源 TRIM5α 背景下引入恒河猴 v1 环不同突变组合的变体，检测其对 SIV_sab的限制能力。

研究结果

1. 错义突变难以赋予人类 TRIM5α 抗 SIV_sab功能：尽管许多单错义突变可使人类 TRIM5α 获得对 HIV - 1 等慢病毒的限制能力，但针对 SIV_sab，单错义突变却无能为力。研究发现，SIV_sab对人类 TRIM5α 的限制是一个极具挑战性的进化难题，其 v1 环中多个关键位置需同时发生特定错义突变才可能获得限制功能。通过对 DMS 文库的筛选和验证，未发现能增强 SIV_sab限制的单错义变体。即使构建人源和恒河猴源 TRIM5α 的 v1 环互换嵌合体及相关组合突变体，也证实至少需要 6 个恒河猴样突变才能使人类 TRIM5α 获得对 SIV_sab的限制功能，且这些突变需同时存在，不存在具有选择优势的进化中间态。
2. Indels 可使人类 TRIM5α 在一步进化中获得抗 SIV_sab功能：对 DIS 文库的筛选结果显示，多个 Indels 变体在 SIV_sab限制筛选池中显著富集。其中，最有效的是 F339dup 突变，仅通过复制一个氨基酸，就能使人类 TRIM5α 获得与替换整个恒河猴 v1 环相当的抗 SIV_sab能力，同时还能限制 HIV - 1 和 SIV_cpz，且不影响对 N - 嗜性小鼠白血病病毒（N - MLV）的限制。该突变的功能增强具有特异性，其长度和间距对功能影响关键，且只有插入芳香族氨基酸才能赋予抗 SIV_sab功能。
3. 自然发生的 TRIM5α Indels 赋予新的抗病毒功能：在灵长类动物中，TRIM5α 频繁进化出 Indels 突变，这些突变集中在病毒结合的 B30.2 结构域内的快速错义突变位点附近。实验表明，恒河猴 TRIM5α 中自然发生的 2 - 氨基酸插入缺失与 SIV_sab限制相关，缺失该插入会消除其对 SIV_sab的限制能力；非洲绿猴（包括 SIV_sab的自然宿主萨拜乌斯猴）TRIM5α 中的 20 - 氨基酸重复对限制 SIV_mac至关重要，且将该重复插入人源或恒河猴源 TRIM5α 中，可赋予其对 SIV_mac的限制功能。

研究讨论

1. Indels 在蛋白质进化中的作用：Indels 在蛋白质编码区域相对罕见，因其常对蛋白质功能产生有害影响，多局限于蛋白质的非结构化区域。然而，在某些情况下，Indels 可使蛋白质获得适应性优势，如在抗体亲和力成熟和酶活性改善中发挥作用。本研究发现，Indels 能让抗病毒蛋白克服病毒挑战，这是错义突变难以实现的，揭示了 Indels 在抗病毒蛋白进化中的重要性。
2. Indels 增强抗病毒功能的机制：与错义突变常通过改变电荷影响宿主 - 病毒蛋白相互作用不同，本研究中最有效的 Indel 变体（F339dup）在不改变电荷的情况下增强了抗病毒功能，且无法通过错义突变产生类似效果。推测 Indels 可能通过改变 v1 环的构象状态，使其更有利于与慢病毒衣壳结合，从而降低结合时的熵罚，增加整体亲和力。
3. 研究的局限性与展望：本研究虽揭示了 Indels 在 TRIM5α 抗病毒功能进化中的重要作用，但存在一定局限性。例如，无法直接测量 TRIM5α 变体与组装衣壳的亲和力，且研究仅局限于框内同相位 Indels，未涉及非同相位 Indels。未来研究应包括非同相位 Indels，以更全面地了解其功能影响。

本研究表明，Indels 是抗病毒蛋白进化中一种关键且常被忽视的新颖性来源，可使抗病毒蛋白跨越错义突变难以逾越的进化障碍，为深入理解宿主 - 病毒相互作用及抗病毒蛋白进化机制提供了重要依据，也为开发新型抗病毒策略提供了新的思路。