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这篇研究利用单分子染色质纤维测序（Fiber-seq）技术，揭示了区域着丝粒核心存在双态染色质（dichromatin），其由紧密压实的核小体阵列和高度可及的染色质斑块组成。该结构在人类和灵长类中保守，且着丝粒功能的保守性在染色质层面介导，对理解基因组稳定性意义重大。
研究背景
着丝粒在基因组维持中至关重要，其可分为 “点” 着丝粒和 “区域” 着丝粒。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的着丝粒是由约 125bp 的点着丝粒构成，基于单个 CENP-A 核小体；而人类着丝粒是区域着丝粒，由约 171bp 的 alpha 卫星重复单元组成高阶重复（HORs），可跨越每条染色体上的数兆碱基。
在人类着丝粒核心，alpha 卫星 HORs 是动粒与基因组结合的遗传底物，动粒与着丝粒核心的相互作用受多种 DNA 结合蛋白调节，包括序列特异性 DNA 结合蛋白 CENP-B 和组蛋白 H3 变体 CENP-A。成像和基因组研究表明，动粒结合仅局限于 alpha 卫星 HOR 阵列的一小部分，该区域以 CENP-A 和 CENP-B 的占据以及低 CpG 甲基化为特征，即着丝粒核心或 “着丝粒凹陷区域”（CDR）。然而，该区域的体内染色质压实和组织情况仍未完全明确，存在一些看似矛盾的染色质特征。
由于 alpha 卫星 HORs 的高度重复 DNA 含量，解析着丝粒内单个染色质纤维的染色质组织以及动粒结合与染色质组织之间的关系颇具挑战。传统的基于短读长测序的染色质分析方法无法独特地解析这些重复 DNA 阵列的染色质结构，也无法确定多个染色质特征在单个染色质纤维上的位置。随着首个端粒到端粒（T2T）人类参考基因组的完成，以及基于甲基转移酶的单分子长读长染色质分析方法的出现，为在单分子和单核苷酸分辨率下研究着丝粒的染色质特征提供了可能。其中，基于非特异性腺嘌呤甲基转移酶（m6A-MTase）的染色质分析方法 —— 单分子染色质纤维测序（Fiber-seq），能够对多千碱基染色质纤维上的染色质可及性、蛋白质占据、核小体定位和 CpG 甲基化进行核苷酸精确映射。
研究方法
- 样本选择：研究选取了酿酒酵母、人类葡萄胎 CHM13 细胞系、CHM1 细胞、GM24385 细胞以及东白眉长臂猿（Hoolock leuconedys）的淋巴母细胞系作为研究对象。
- Fiber-seq 实验流程：以 CHM13 细胞为例，细胞在 AmnioMax C-100 基础培养基中培养至约 90% 汇合度，经胰蛋白酶消化后收集细胞。将细胞裂解获取细胞核，在细胞核中加入 Hia5 MTase 和 S - 腺苷甲硫氨酸进行反应，以标记染色质结构。随后进行 DNA 提取、纯化，对 DNA 进行片段化处理，并构建 SMRTbell 文库，使用 PacBio Sequel II 进行测序。其他细胞系的 Fiber-seq 实验流程与之类似，仅在细胞培养条件上有所差异。
- 数据分析方法：利用多种软件对测序数据进行处理和分析。如使用 pbmm2 将未比对的子读段转换为 HiFi 读段并与相应参考基因组比对；通过 fibertools-rs 预测单分子 m6A 事件；运用 PacBio 的工具套件识别单分子 mCpG 事件；借助 fibertools-rs 添加核小体和 MSP 等特征。此外，还使用了多种算法和工具来确定着丝粒核心区域、测量染色质重复长度、分析 CENP-B 结合元件和占据情况等。
研究结果
- 点着丝粒的单分子染色质结构：对酿酒酵母进行 Fiber-seq 分析发现，超过 90% 覆盖酵母着丝粒的染色质纤维在 CDEI - III 元件处存在 MTase 保护区域，该区域与酵母内动粒的冷冻电镜结构完美对齐，且在 Cse4 不稳定时会被破坏。同时，酵母着丝粒常被 MTase 敏感的染色质斑块（MSPs）侧翼包围，表明酵母 CCAN 与局部染色质结构的显著改变相关。这揭示了 Fiber-seq 能够在单分子和近单核苷酸分辨率下解析 CCAN 的染色质结构，且单个纤维显示出均匀的 CCAN 占据，常与可及染色质斑块相邻。
- 人类着丝粒核心的双态染色质特征：对人类 CHM13 细胞系进行 Fiber-seq 研究时发现，与酵母点着丝粒不同，CHM13 区域着丝粒缺乏均匀定位的染色质。CHM13 着丝粒核心的核小体结构与人类基因组其他区域不同，含有明显小于平均核小体足迹的单核小体，且有大量二核小体足迹，表明存在紧密压实的核小体阵列。同时，着丝粒核心富含大的 MSPs，形成了人类基因组中最易接近的染色质区域之一。单个染色质纤维上同时存在紧密压实的核小体阵列和高度可及的染色质特征，这种双态染色质组织（dichromatin）在基因组其他地方未被发现，且与动粒的附着和功能可能直接相关。
- CENP-B 对双态染色质的影响：通过对 CHM13 细胞的研究发现，着丝粒核心的 alpha 卫星区域核小体重复单元为 170bp，与 alpha 卫星 DNA 的重复长度一致，而失活或发散 / 单体的 alpha 卫星 HORs 核小体重复单元为 190 - 193bp，说明 alpha 卫星重复本身不足以使染色质反映其底层 DNA 重复。CENP-B 结合在 alpha 卫星 HORs 内的非回文 A/T 丰富的 17bp CENP-B 盒上，通过 Fiber-seq 可在体内解析其占据情况。CENP-B 盒的占据受 CpG 甲基化调控，低 CpG 甲基化的 CENP-B 盒优先与可及染色质斑块重叠，并组织双态染色质相对于底层 alpha 卫星 DNA 重复的结构。但在 Y 染色体着丝粒（缺乏 CENP-B 盒）上，虽也存在双态染色质，但高阶染色质组织不反映底层 alpha 卫星重复单元，表明双态染色质的形成可独立于 CENP-B。
- 双态染色质结构的保守性：对 CHM1 和 GM24385 细胞进行 Fiber-seq 分析发现，尽管不同个体着丝粒核心区域的序列和位置存在差异，但都存在双态染色质，且在含有 CENP-B 盒的着丝粒中，核心区域的染色质重复单元为 170bp。对东白眉长臂猿的研究显示，其着丝粒核心虽缺乏 alpha 卫星重复，但仍存在双态染色质，不过其高阶染色质组织与侧翼区域的规范染色质重复单元连续，只是因双态染色质特征而略显无序。这表明双态染色质是着丝粒核心染色质压实的保守特征，与底层 DNA 序列无关。
研究讨论
- 双态染色质的功能意义：研究揭示了着丝粒核心存在一种独特的染色质压实形式 —— 双态染色质，其同时包含基因组中最易接近和最紧密压实的染色质。可及染色质斑块在着丝粒核心形成了高度可塑性的染色质拓扑结构，有利于维持着丝粒核心的蛋白质结合。这些斑块的聚类可能与 CENP-B 的作用有关，但即使在缺乏 CENP-B 占据的着丝粒上也存在，说明 CENP-B 可能只是稳定染色质固有特性的一种机制。
- 对结构研究的指导意义：研究中对酵母和灵长类着丝粒蛋白质占据的图谱，有助于指导未来对 CCAN 在体内动态组装的结构研究。酵母数据显示，酵母点着丝粒在体内被 CCAN 动态占据，不同染色体和纤维之间存在差异，这提示在对酵母 CCAN 的结构理解中需要考虑这些动态变化。
- 着丝粒的进化与保守性：着丝粒是真核生物基因组中进化最快的 DNA 序列，着丝粒核心染色质组织的显著异质性可能使动粒附着对序列和结构的变异性具有免疫性。双态染色质结构在个体间高度保守，且可在缺乏 alpha 卫星重复的着丝粒核心中组装，表明着丝粒的功能保守性在染色质层面而非 DNA 层面介导，这使得着丝粒在维持整体染色质结构的同时，其底层 DNA 序列具有较大可塑性。
研究局限
- 蛋白质身份难以确定：Fiber-seq 虽能观察到蛋白质足迹，但无法确定引起这些足迹的具体蛋白质身份。例如，在人类和长臂猿着丝粒中观察到的特定大小足迹，怀疑与 CCAN 的占据有关，但需要进一步研究验证。
- 细胞周期同步性问题：研究中的染色质图谱是在异步分裂的细胞中获得的，无法反映细胞周期不同阶段染色质组织的变化情况。
研究展望
本研究为着丝粒染色质结构的研究提供了重要见解，但仍有许多问题有待进一步探索。未来的研究可以深入探究双态染色质在着丝粒内外的具体功能机制，以及其与其他染色质修饰和调控因子的相互作用。同时，开发更先进的技术来确定蛋白质足迹的具体身份，以及在同步化细胞中研究染色质组织，将有助于更全面地理解着丝粒的生物学功能和基因组稳定性的维持机制。
