基底神经节输出通路新解：遗传差异神经元亚类构建功能特异性回路

这篇研究揭示了黑质网状部（SNr）包含遗传上不同的神经元亚型，它们在拓扑结构上有序排列，投射到不同脑区并接收不同输入，且在人类中保守。此发现为理解基底神经节回路如何调控下游脑区提供关键线索，对解析相关疾病机制意义重大。

　　

研究背景

神经系统通过不同神经回路控制行为，基底神经节（basal ganglia）是其中重要组成部分，它由一系列解剖上分离且拓扑结构有序的子回路构成，可调节多种感觉运动、认知和动机行为。深入了解基底神经节的组织结构逻辑，对明确其特定子回路功能障碍在相关神经精神疾病（如运动障碍、强迫症等）中的作用，以及开发精准治疗方法至关重要。虽然全脑映射技术已揭示了皮质 - 基底神经节环路（cortico-basal ganglia loops）的精细组织逻辑，但不同基底神经节输出回路的解剖组织、发育过程中的组装以及神经元细胞类型的分子多样性之间的对应关系仍不明确。

研究人员推测，黑质网状部（substantia nigra pars reticulata，SNr）作为基底神经节的主要输出核，其解剖组织可能反映不同的遗传谱系，因为 SNr 由不同的祖细胞群体形成，这些祖细胞定居在不同的解剖区域。本研究旨在利用单细胞核转录组学技术，探究 SNr 中神经元的遗传多样性和拓扑组织结构，以及它们与基底神经节回路功能的关系。

实验方法

1. 单细胞核 RNA 测序（snRNA-seq）：研究人员选取 9 只 12 周龄小鼠，对其 SNr 区域进行显微解剖，随后进行核分离、NeuN 标记和荧光激活细胞核分选（fluorescence-activated nuclei sorting，FANS），收集 DAPI⁺;NeuN⁺细胞核用于 10× 测序。通过 Seurat 软件进行迭代无偏聚类分析，确定最优聚类参数，从而识别 SNr 神经元的不同亚类。
2. 基因标记和解剖追踪：运用遗传和解剖学策略，借助病毒标记技术，研究人员对特定 SNr 神经元亚类进行标记，以探究其投射靶点和输入来源。例如，通过向特定脑区注射病毒，逆行标记投射到该区域的 SNr 神经元，进而分析这些神经元的基因表达特征；同时，利用顺行追踪技术，标记特定亚类的 SNr 神经元，观察其在全脑的投射模式。
3. 狂犬病病毒追踪：采用狂犬病病毒追踪技术，研究人员能够确定不同 SNr 亚类的纹状体输入。具体操作是，向特定的 SNr 亚类注射狂犬病辅助病毒和病毒，标记起始细胞和突触前输入细胞，通过对脑切片的分析，确定输入细胞在纹状体中的分布情况。
4. 数据分析：使用多种软件和工具对实验数据进行分析。如利用 Seurat 和 Harmony 软件进行数据整合和聚类分析，通过 MapMyCells 函数将 SNr 数据集映射到艾伦脑图谱细胞分类法（Allen Brain Cell Atlas，ABCA）中，以确定神经元亚类的分类地位；运用各种统计方法对实验结果进行量化和分析，评估数据的显著性差异。

实验结果

1. SNr 神经元亚类的鉴定与分布：通过 snRNA-seq 分析，研究人员在排除低质量样本后，对剩余样本进行聚类分析，共得到 12 个聚类，其中 7 个聚类为 GABA 能神经元，被认为是潜在的 SNr 神经元。进一步分析发现，这些 GABA 能神经元可分为 3 个主要亚类，分别为 Six3/Foxp2、Pou6f2/Pax5 和 Tcf7l2/Scn5a。通过原位杂交和免疫组化实验，研究人员确定了这些亚类在成年 SNr 中的空间分布。结果显示，Foxp2 主要在背外侧 SNr 表达，Pax5 和 Pou6f2 在腹内侧 SNr 共表达，Scn5a 在最背外侧区域（对应黑质外侧部，substantia nigra lateralis，SNL）表达。此外，研究还发现 Six3/Foxp2 亚类在成年 SNr 中更偏向于前部，而 Pou6f2/Pax5 亚类更偏向于后部，这与它们的祖细胞来源相对应。同时，研究人员还对已知的 SNr 标记基因 Pvalb 进行分析，发现所有三个亚类均含有表达 Pvalb 的神经元，但 Pvalb 单独表达不足以清晰区分不同亚类。
2. SNr 神经元亚类与投射靶点的关系：研究人员通过向 6 个不同的靶区域注射 AAVretro-hSyn-H2B-mCherry，逆行标记投射到这些区域的 SNr 神经元，并对其进行 snRNA-seq 分析。结果发现，大多数从特定靶区域逆行标记的 SNr 神经元映射到单个 ABCA 亚类。例如，从外侧上丘（lateral superior colliculus，LSC）和内侧上丘（medial superior colliculus，MSC）逆行标记的神经元主要映射到 Six3/Foxp2 亚类；从下丘（inferior colliculus，IC）逆行标记的神经元主要映射到 Tcf7l2 亚类；从背侧缝核（dorsal raphe，DR）、脑桥网状核（pontine reticular nucleus，PNo）和延髓网状核（medullary reticular nucleus，Med）逆行标记的神经元主要映射到 Pax5/Pou6f2 亚类。这些结果表明，投射到不同脑区的 SNr 神经元对应不同的亚类。此外，研究人员通过结合逆行标记和组织学标记表达，进一步验证了这一结论。
3. SNr 神经元亚类的全脑投射模式：利用病毒标记技术，研究人员对 3 个 SNr 亚类的全脑投射模式进行了表征。结果发现，所有 SNr 亚类都向已知的共同靶点（如脚桥核、未定带和导水管周围灰质）发送投射，但在向特定下游靶点的投射上存在差异。例如，Foxp2 亚群主要投射到上丘，Pou6f2 亚群投射到脑桥和延髓，SNr-IC 亚群投射到 IC 的外壳，并向上丘发送额外的侧支。此外，3 个亚类在向丘脑靶点的投射上也有所不同，Foxp2 亚群主要投射到丘脑腹内侧核，Pou6f2 亚群投射到丘脑背内侧核，SNr-IC 亚群投射到丘脑后内侧核、后三角丘脑核和内侧膝状体复合体。
4. SNr 神经元亚类的纹状体输入差异：运用狂犬病病毒追踪技术，研究人员发现不同的 SNr 亚类从纹状体接收的输入存在差异。Foxp2 SNr 亚类在大多数纹状体亚区域都有标记的突触前输入细胞；Pou6f2 SNr 亚类的突触前输入偏向于纹状体的腹内侧亚区域；SNr-IC 亚类的突触前输入则偏向于纹状体的尾部。这表明遗传上不同的 SNr 亚类从纹状体接收的输入模式存在重叠但又不完全相同。
5. SNr 神经元亚类在人类中的保守性：研究人员分析了已发表的人类中脑神经元 snRNA-seq 数据集，对 39,110 个人类非多巴胺能神经元进行整合和聚类分析。结果发现，8 个 GABA 能神经元聚类中有 6 个表达与小鼠中观察到的相同配置的已知标记。其中，2 个聚类共表达 SIX3、FOXP2、ADARB2 和 SEMA3E，类似于小鼠中的 Six3/Foxp2 SNr 亚类；2 个聚类共表达 ZFPM2、POU6F2 和 PAX5，类似于小鼠中的 Pax5/Pou6f2 SNr 亚类；1 个聚类表达 TCF7L2；还有 1 个聚类共表达 FOXP2、ZFPM2、MEIS2、OTX2 和 RELN，类似于小鼠中的 Sox14 聚类，但似乎与 SNr 不对应。这些结果表明，小鼠和人类的 SNr 在神经亚型和基因表达模式上存在显著的对应关系。
6. 利用神经亚类探究疾病病理：研究人员将 8 名对照捐赠者的 39,110 个人类非多巴胺能样本与 7 名帕金森病（Parkinson’s disease，PD）捐赠者的 34,779 个非多巴胺能样本进行合并和整合分析。在对两个最大的亚类 SIX3/FOXP2 和 PAX5/POU6F2 进行差异基因表达分析后发现，尽管 PD 样本中相邻的黑质致密部（substantia nigra pars compacta，SNc）多巴胺神经元大量丢失，但 SNr 中的基因表达在很大程度上保持不变，不过不同亚类之间可能存在细微差异。

研究讨论

1. SNr 中保守的神经元多样性：本研究通过在 SNr 发育起源的背景下，利用分层分类框架对其转录组多样性进行表征，扩展了以往对 SNr 多样性的研究。研究发现，SNr 在亚类水平上组织，亚类对应不同的发育祖细胞群体，它们在 SNr 中定居在不同的空间区域，并投射到不同的靶区域。虽然在更高分辨率下聚类可检测到亚类内的转录差异，但 SNr 超类或聚类名称在定居位置或连接性上似乎没有显著差异，亚类内的转录组变异可能与神经元功能的其他细胞特性相关。此外，本研究还发现 SNr 亚类在物种间似乎是保守的，这为进一步研究脊椎动物进化过程中 SNr 细胞多样性的产生和维持提供了重要线索。
2. SNr 细胞类型的发育起源：本研究的一个关键发现是，SNr 的转录组亚类组织似乎与胚胎发育中形成 SNr 的不同祖细胞池相对应。Six3⁺中脑祖细胞群体形成前 SNr，Zfpm2⁺;Pax5⁺腹侧菱脑 r1 祖细胞群体形成后 SNr，Six3/Foxp2 和 Pax5/Pou6f2 亚类似乎分别源自这两个祖细胞群体。然而，第三个 Tcf7l2/Scn5a 亚类的起源尚不清楚，未来需要进一步的发育测序和谱系追踪研究来明确。有趣的是，不同祖细胞起源的 SNr 神经元在成年后的连接性存在差异，这表明发育规范可能影响神经元的定居位置和轴突分支模式。
3. 空间组织和电路：SNr 中不同亚类的发育规范决定了它们在 SNr 中的不同定居位置和解剖电路。Six3/Foxp2 SNr 亚类定居在更前部和背外侧区域，接收广泛的纹状体输入，并投射到上丘；Pax/Pou6f2 SNr 亚类定居在更后部和腹内侧区域，接收来自纹状体腹内侧的偏向输入，并投射到后脑靶点；Tcf7l2/Scn5 SNr 亚类占据最背外侧亚区域，接收来自纹状体尾部的偏向输入，并投射到 IC 外壳和上丘。这些发现与先前的解剖追踪研究结果一致，但亚类名称并不能完全解释 SNr 解剖电路的复杂性，在每个亚类中，神经元还可根据其具体的定居位置、纹状体输入和投射到特定下游靶点进一步分类。
4. 对行为和疾病的影响：基底神经节输出电路通过专门的投射和广泛的侧支化来调节行为，本研究进一步表明，SNr 亚类的分子分离支持了不同感觉运动功能的参与。例如，Six3/Foxp2 SNr 神经元可能通过投射到上丘参与定向行为；Pax5/Pou6f2 SNr 神经元可能通过投射到后脑参与调节运动；Tcf7l2/Scn5a SNr 神经元可能通过来自纹状体尾部的输入和投射到 IC 来调节感觉驱动的运动行为。此外，Pax5/Pou6f2 亚群可能在奖励处理中发挥特殊的边缘作用。在疾病方面，本研究表明在 PD 中，SNr 电路的基因表达仅发生细微变化，但不同的 SNr 神经元亚群在多巴胺缺失时可能表现出不同的电生理变化，这可能解释了它们在 PD 病理生理学中的不同作用。鉴于 SNr 是深部脑刺激治疗的当前靶点，明确 SNr 亚群的区域和分子特化可能有助于指导和开发更精确的细胞类型特异性治疗方法。
5. 研究的局限性：本研究利用转基因和病毒工具来探究 SNr 的分子组织，但这些遗传工具存在固有的局限性，如不同的重组效率、病毒的不同遗传结构和滴度等，这限制了实验间的定量比较。此外，本研究中使用的 Foxp2 和 Pou6f2 标记策略也存在特定的局限性，如 Pou6f2-Flp 小鼠仅标记 70% 的内源性 Pou6f2 表达神经元，可能导致 Pou6f2 电路在追踪实验中代表性不足；而 Foxp2-Cre 和 Vgat-Flp 小鼠的交叉标记策略可能会标记 SNr 外的 GABA 能 Foxp2⁺神经元，这可能会混淆狂犬病实验的结果。未来需要开发更特异性的遗传工具和解剖标记策略来进一步研究基底神经节亚电路的组织和功能。}