治疗性激活产生 IL-22 的天然淋巴细胞可增强宿主对艰难梭菌感染的防御

《Cell Reports》：Therapeutic activation of IL-22-producing innate lymphoid cells enhances host defenses to Clostridioides difficile infection

这篇研究发现，口服 Toll 样受体（TLR）7 激动剂 R848 能保护小鼠免受致死性艰难梭菌（C. difficile）感染，其通过激活产生 IL-22 的天然淋巴细胞（ILCs），修复肠黏膜屏障，限制毒素扩散，为治疗艰难梭菌感染提供了新方向。

　　

艰难梭菌感染现状与研究背景

艰难梭菌（Clostridioides difficile）是医院获得性胃肠道感染的常见致病菌，在全球范围内导致较高的发病率和死亡率。它通常在肠道共生菌群因广谱抗生素使用等因素被破坏后，感染易感个体的大肠。其主要毒力因子毒素 A（TcdA）和毒素 B（TcdB）会破坏肠屏障，引发强烈炎症反应，还可能导致全身并发症，如心肺骤停、急性呼吸窘迫综合征等。目前的抗生素治疗效果不佳，约 20%-30% 的患者会复发感染。

宿主的免疫反应在艰难梭菌感染的病程中起着关键作用，包括抵抗和耐受两种策略。抵抗机制通过降低病原体载量保护宿主，而疾病耐受则是在不直接影响病原体载量的情况下，减少病原体或宿主免疫反应带来的负面影响。天然淋巴细胞（Innate lymphoid cells，ILCs）在抵抗急性艰难梭菌感染中至关重要，其中 ILC1s 和 ILC3s 能迅速产生效应细胞因子，如干扰素（IFN）-γ、白细胞介素（IL）-22 和粒细胞 - 巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF），激活炎症细胞、促进抗菌因子产生并修复肠屏障。IL-22 在艰难梭菌感染防御中也发挥着重要作用，可增强外周器官中补体介导的病原体清除，并调节宿主糖基化，促进共生微生物生长以抑制艰难梭菌。然而，目前仍需寻找更有效的方法来治疗艰难梭菌感染，减少疾病负担。

R848 治疗对小鼠艰难梭菌感染的保护作用

研究人员为了探究能否通过增强宿主防御机制来对抗艰难梭菌感染，选择了 Toll 样受体（TLR）7 激动剂 R848 进行研究。此前有报道称 R848 可激活回肠中的 ILC3s。实验中，研究人员先给小鼠使用抗生素破坏其肠道菌群，使其对艰难梭菌易感，然后分别给予小鼠 R848 或水（对照组），并口服感染艰难梭菌孢子（菌株 VPI 10463）。

结果显示，对照组小鼠在感染后第 2 天出现严重疾病症状，并迅速死亡；而 R848 治疗组小鼠的疾病症状明显减轻，存活率显著提高。进一步研究发现，R848 治疗组和对照组小鼠的粪便和盲肠内容物中的艰难梭菌定植水平以及毒素滴度相似，但 R848 治疗组小鼠的盲肠组织损伤明显减轻，主要表现为上皮细胞损失和死亡减少。这表明 R848 治疗增强了宿主对艰难梭菌毒素介导的肠上皮损伤的耐受性。

研究人员还探究了 R848 治疗的最佳时机，发现感染前一天和感染当天给予 R848（预防性给药）并不能保护小鼠免受严重疾病，而在感染后第 1 天给予单剂量 R848（治疗性给药），能使小鼠疾病症状减轻，效果与全程给药相似，说明 R848 可在感染后进行治疗性给药。

为了解 R848 保护肠屏障的机制，研究人员进行了一系列实验。R848 单独处理结肠上皮细胞系 CaCO₂，未观察到细胞形态变化；同时，CaCO₂细胞在接受不同浓度 R848 和艰难梭菌 TcdB 处理后，细胞变圆情况与仅用 TcdB 处理相似，这表明 R848 的保护作用并非通过直接抑制艰难梭菌毒素活性实现。此外，对感染当天收集的粪便进行 16S rRNA 基因测序分析发现，R848 处理组和对照组的微生物组成相似，说明 R848 的保护作用与肠道菌群变化无关。

R848 保护作用的相关机制研究

R848 通常通过 TLR7 和 TLR8 信号诱导 I 型干扰素（IFN）反应，但 TLR8 在小鼠中无功能。为证实 R848 通过 TLR7 信号介导保护作用，研究人员用 R848 或对照处理 Tlr7^?/?小鼠和 C57BL/6 小鼠，并感染艰难梭菌。结果显示，R848 能保护 C57BL/6 小鼠，但对 Tlr7^?/?小鼠无保护作用，证实了 TLR7 在 R848 介导的保护中的重要性。

I 型 IFNs 是主要的抗病毒细胞因子，在小鼠接受 R848 处理后会迅速诱导产生。研究人员用 R848 或对照处理 Ifnar^?/?小鼠和 C57BL/6 小鼠，并感染艰难梭菌，发现 R848 同样能保护 Ifnar^?/?小鼠免受严重疾病，降低死亡率，表明 I 型 IFN 信号在 R848 介导的保护中并非必需。

ILCs 在宿主对艰难梭菌感染的早期反应中起关键作用。研究人员检测了未感染小鼠口服 R848 后结肠组织的基因表达水平，发现 R848 能诱导结肠中 IFN-β（Ifnb1）、IL-23（Il23a）、IL-1β（Il1b）、IL-22（Il22）、IFN-γ（Ifng）等细胞因子以及下游趋化因子（Cxcl1 和 Ccl2）和抗菌肽（Reg3g、S100a8）的表达，且 IL-22 结合蛋白（Il22ra2）的表达不受影响。

进一步分析免疫细胞群体发现，R848 处理 3 小时后，小鼠大肠固有层中的中性粒细胞浸润显著增加，单核细胞数量也有增加趋势，但 24 小时后恢复到对照组水平。此外，R848 处理能诱导 ILCs 中 IL-22 和 IFN-γ 的表达，而在 CD4⁺T 细胞和 γδ T 细胞中未观察到这种现象，表明 R848 刺激后，肠道相关淋巴组织中存在树突状细胞 - IL-23-ILC-IL-22 信号轴。

研究人员通过一系列实验确定 R848 的保护作用由产生 IL-22 的 ILCs 介导。首先，给感染艰难梭菌的 Rag1^?/?小鼠（缺乏 T 和 B 淋巴细胞）使用 R848，小鼠的疾病症状和死亡率降低，说明 T 和 B 淋巴细胞并非 R848 介导保护所必需。而在 Nfil3^?/?小鼠（缺乏所有 ILC 和自然杀伤细胞亚群，但 T 和 B 细胞功能正常）中，R848 无法降低疾病症状和提高存活率，证实了 R848 的保护作用依赖于 ILCs。

IL-22 在艰难梭菌感染防御中具有保护作用，且 R848 能诱导其在大肠中表达。研究发现，与 C57BL/6 小鼠不同，Il22^?/?小鼠接受 R848 处理后，疾病严重程度和死亡率与对照组相似，结肠组织病理学分析也显示无改善，表明 R848 的保护作用依赖于 IL-22。此外，Rag1^?/?Il22^HET和 Rag1^?/?Il22^?/?小鼠的实验进一步证实了这一点。同时，研究发现 R848 诱导的 IL-22⁺ILCs 表达 Rorγt，表明这些细胞是 ILC3s。

虽然 R848 处理会导致趋化因子上调、中性粒细胞快速募集和 ILC 激活，但在感染后第 2 天，R848 处理组和对照组小鼠的炎症细胞因子、趋化因子和抗菌肽基因表达水平相当，中性粒细胞和单核细胞的频率和总数也相似，说明 R848 的保护作用并非由浸润的炎症细胞驱动。而 R848 处理的感染小鼠大肠固有层和肠系膜淋巴结中的 IL-22 产生的 ILCs 数量增加，进一步支持了该细胞群体在 R848 介导保护中的重要性。

IL-22 对肠上皮细胞的作用及对肠道屏障的影响

IL-22 受体在多种非造血组织中表达，包括胃肠道上皮。此前研究表明，微生物群可刺激 IL-22 信号传导，诱导上皮糖基化，促进共生菌生长以抑制艰难梭菌。同时，艰难梭菌毒素介导的上皮损伤与紧密连接蛋白丢失和干细胞功能受损有关。

研究人员评估了 R848 处理对 C57BL/6 和 Il22^?/?小鼠上皮糖基化和连接基因表达的影响。结果发现，R848 处理 24 小时后，宿主糖基转移酶基因 Mgat4a、Mgat5 和 St6gal1 以及紧密连接蛋白 ZO-1（由 Tjp1 编码）的表达以 IL-22 依赖的方式降低，这表明 R848 介导的保护作用并非由上皮糖基化或连接蛋白表达增加所驱动。

IL-22 信号在艰难梭菌感染时可导致结肠上皮中 STAT3 磷酸化，其保护和再生特性主要通过该转录因子介导。R848 处理最早在 3 小时就能以 IL-22 依赖的方式诱导大肠上皮细胞中 STAT3 磷酸化。为确定肠道上皮 STAT3 信号在 R848 介导保护中的作用，研究人员构建了上皮特异性 STAT3 条件性敲除小鼠（Stat3^ΔIEC）。实验结果显示，R848 能减轻对照小鼠（Stat3^flox）的疾病症状，但对 Stat3^ΔIEC小鼠无效，说明 R848 诱导的 IL-22 作用于肠道上皮细胞，激活 STAT3 依赖的保护机制。

肠道上皮在受损后需要进行修复以恢复屏障功能，IL-22 可通过 STAT3 信号刺激上皮细胞增殖，促进组织修复。研究人员用 R848 或对照处理 C57BL/6 和 Il22^?/?小鼠，12 小时后通过 5 - 乙炔基 - 2'- 脱氧尿苷（EdU）掺入评估干细胞增殖。结果发现，R848 处理显著增加了 C57BL/6 小鼠中 EdU⁺肠干细胞的比例，但对 Il22^?/?小鼠无此作用。组织病理学观察显示，R848 处理的 C57BL/6 小鼠盲肠和结肠中的上皮细胞损失减少。

此外，感染后第 2 天的流式细胞术分析表明，R848 处理的小鼠大肠中活上皮细胞比例更高，说明 R848 处理可限制上皮损伤。通过测量感染后第 2 天口服荧光素异硫氰酸酯（FITC）- 葡聚糖后血清中的含量来评估肠道通透性，发现艰难梭菌感染导致对照组小鼠循环中 FITC - 葡聚糖增加，而 R848 处理显著降低了这一水平。同时，测量盲肠内容物中的血清蛋白白蛋白水平（另一种衡量肠道损伤的指标）发现，感染小鼠的白蛋白水平高于未感染对照组，R848 处理虽未达到统计学显著差异，但有降低趋势。研究还发现，R848 处理对肾脏和盲肠组织的血管通透性无影响，表明其降低通透性的作用主要发生在上皮屏障。综合这些结果，R848 通过刺激干细胞增殖和促进上皮细胞存活，以 IL-22-STAT3 依赖的方式限制毒素诱导的肠屏障功能丧失。

R848 对艰难梭菌毒素扩散及全身疾病的影响

艰难梭菌毒素 TcdA 和 TcdB 的全身扩散与严重疾病相关。研究人员评估了 R848 处理对循环毒素的影响，以确定其改善宿主感染后存活率的机制。通过检测感染后第 2 天小鼠血清中是否存在毒素（采用培养的 Vero 细胞变圆法），发现 R848 处理组小鼠血清中检测到毒素的频率（30%）低于对照组（71%）。

毒素血症会导致全身并发症和肠外器官损伤。研究人员比较了循环中全身疾病标志物的水平，发现感染后小鼠血清中尿素水平升高，而 R848 处理显著降低了这一水平；血清肌酐水平在感染后也升高，R848 处理虽未达到统计学显著差异，但有降低趋势；感染导致血清葡萄糖水平下降，R848 处理使其有升高趋势。这些结果表明，R848 处理可促进肠屏障完整性，限制艰难梭菌毒素扩散，从而预防全身疾病。

研究讨论与局限性

免疫防御包括抵抗和耐受机制，对于艰难梭菌感染，有效的免疫防御不仅要清除病原体，还要促进肠道组织对毒素介导损伤的耐受。本研究表明，治疗性刺激 IL-22 轴可使宿主耐受艰难梭菌感染后的黏膜损伤，为肠道菌群恢复和清除病原体争取时间。

R848 作为 TLR7 激动剂，可短暂激活先天免疫防御，增加宿主对艰难梭菌感染的耐受性，减少黏膜损伤和毒素扩散，其保护作用由产生 IL-22 的 ILC3s 介导，通过激活肠道上皮细胞的 STAT3 依赖的再生途径发挥作用。此前研究表明，R848 可通过刺激树突状细胞产生 IL-23，进而刺激 ILC 产生 IL-22，减少耐万古霉素肠球菌的定植。本研究进一步证实 R848 介导的 IL-22 刺激对多种肠道病原体具有保护作用，且主要促进宿主组织对毒素介导损伤的耐受，而非影响病原体载量。

虽然已有多种机制解释 IL-22 在艰难梭菌感染中的保护作用，如诱导肝脏补体蛋白表达、调节宿主上皮糖基化等，但本研究发现 R848 处理对微生物群组成和艰难梭菌定植水平无显著影响，表明其保护机制与之前报道的有所不同。

IL-22 在肠道上皮修复中发挥着重要作用，可刺激上皮细胞增殖、促进细胞存活和调节上皮连接基因表达等。R848 诱导的 IL-22 有助于修复毒素诱导的上皮损伤，但同时也发现 R848 导致的一些基因表达变化与通透性增加和屏障功能障碍一致。此外，IL-22 还在维持对肠道微生物群的耐受性方面发挥作用，虽然 R848 处理对艰难梭菌定植和微生物群组成无影响，但共生菌代谢的差异可能有助于减轻 R848 处理小鼠的疾病严重程度，说明 IL-22 信号下游的多种机制可能共同发挥作用，保护机体免受肠道感染。

本研究也存在一定局限性。R848 处理虽未导致明显病理迹象，但广泛激活先天免疫系统可能存在潜在不良影响。例如，炎症性肠病（IBD）患者的慢性炎症是艰难梭菌感染的危险因素，且与更高的死亡率相关，而 R848 诱导的 IL-23 通路在 IBD 发病机制中起关键作用，阻断 IL-23 的抗体用于治疗 IBD。因此，开发更具针对性的方法，特异性刺激 IL-22 信号通路，可能更适合减轻艰难梭菌感染的严重程度。近期开发的一些递送系统，如通过重组融合蛋白、mRNA 脂质纳米颗粒或工程菌递送 IL-22，为治疗艰难梭菌感染提供了新的潜在途径。