非经典吞噬样过程 SEAL：解锁哺乳动物受精的关键机制

这篇研究发现，非经典吞噬样过程 “精子吞噬激活因子 IZUMO1-JUNO 连接及配子融合相关因子”（SEAL）对哺乳动物受精至关重要。研究揭示了配子识别和融合的机制，明确 IZUMO1-JUNO 复合物等关键因素的作用，为深入理解受精过程提供重要依据。

　　

研究背景

在哺乳动物的繁衍过程中，受精是至关重要的环节，只有最具活力的精子能够突破重重生理障碍，抵达卵子并完成受精。这一过程涉及多个复杂阶段，其中配子的识别与融合是核心步骤，受到多种因素的严格调控。在脊椎动物中，精子的 Izumo 精子 - 卵子融合 1（IZUMO1）与卵母细胞的 JUNO（IZUMO1R）之间的相互作用，在配子识别阶段发挥着关键作用。此外，基因敲除研究还发现了许多其他对配子融合必不可少的膜锚定蛋白，如精子中的树突状细胞特异性跨膜蛋白（DC - STAMP）结构域包含蛋白 1 和 2（DCST1/2）、精子顶体相关蛋白 6（SPACA6）、跨膜蛋白 95（TMEM95）、受精影响膜蛋白（FIMP）等，以及卵母细胞中的分化簇 9（CD9）。然而，目前配子识别和融合的具体分子机制仍不明确。

研究结果

1. 卵膜 JUNO 聚集依赖于 IZUMO1 - JUNO 相互作用：研究人员通过对多种基因敲除和突变小鼠的配子进行实验，发现 JUNO 在卵母细胞表面的聚集状态与 IZUMO1 - JUNO 的相互作用密切相关。将 JUNO 或 CD9 的聚集状态分为五个等级，研究发现 IZUMO1、JUNO 和 CD9 缺陷型小鼠以及 IZUMO1^W148A和 JUNO^L81A突变型小鼠的精子，对 JUNO 的招募有限；而 DCST1/2、SPACA6 和 TMEM95 缺陷型小鼠的精子，JUNO 招募正常。这表明 IZUMO1 - JUNO 复合物的形成能够触发 JUNO 在顶体反应精子接触部位的聚集。
2. 两个差异调节的预融合阶段的鉴定：利用场发射扫描电子显微镜（FE - SEM）和相关光电子显微镜（CLEM）对精子 - 卵母细胞相互作用表面的超微结构进行研究，发现 JUNO 信号强烈的区域对应微绒毛富集，而 JUNO 信号减弱的区域则呈现出类似吞噬的独特结构，研究人员将其命名为 SEAL。成功受精的卵母细胞会经历 SEAL 过程，而配子融合缺陷的突变体则无法形成 SEAL。根据形态特征，这些突变体可分为配子识别失败组和无效卵母细胞触手组，这表明卵母细胞触手和 SEAL 过程在配子融合中发挥着重要作用，且它们的调节机制不同。
3. SEAL 在体细胞中的重现：为了探究 IZUMO1 和 JUNO 的相互作用是否足以诱导 SEAL，研究人员在表达 mScarlet - 小鼠 JUNO 的淋巴细胞来源的 K562 细胞（K562/mScarlet - JUNO）中进行了精子细胞结合实验。结果发现，当 K562/mScarlet - JUNO 细胞与野生型精子共孵育时，精子会出现卵母细胞触手阶段或 SEAL 形成；而 IZUMO1^W148A突变型精子则无法进入卵母细胞触手阶段，DCST1/2 - 破坏的精子则停滞在卵母细胞触手阶段，无法进展到 SEAL 阶段。这进一步证明了 IZUMO1 - JUNO 相互作用是 SEAL 形成的初始触发因素。
4. 肌动蛋白聚合在 SEAL 形成中的作用：由于微绒毛动力学与肌动蛋白聚合密切相关，研究人员对 K562/mScarlet - JUNO 与表达 IZUMO1 - cfSGFP2 的 K562 细胞（K562/IZUMO1 - GFP）进行混合孵育实验。结果显示，K562/mScarlet - JUNO 细胞向 K562/IZUMO1 - GFP 细胞伸出突起，类似吞噬杯形成，且 IZUMO1 和 JUNO 在界面处聚集，同时在 K562/mScarlet - JUNO 细胞上检测到肌动蛋白聚合。在小鼠配子中，卵母细胞表面 JUNO 聚集与肌动蛋白聚合几乎完全重合，但在 SEAL 形成区域未检测到肌动蛋白聚合。这表明微绒毛肌动蛋白聚合可能仅在配子黏附阶段起作用，对 SEAL 形成或精卵融合并非必需。
5. 预融合阶段时间线的确定：为了明确 JUNO 聚集和解散在精子 - 卵子融合过程中的生理作用，研究人员构建了由 ZP3 启动子驱动的转基因表达 GFP - JUNO 的小鼠，并进行了时间分辨分析。结果发现，顶体反应的精子与卵膜结合后，JUNO 会立即在精子头部积累，11 分钟后信号迅速扩散并消散，12 分钟时 Hoechst 信号侵入精子赤道段，表明配子融合发生。不过，由于 Hoechst 33342 染料转移存在延迟，精确的时间顺序仍难以确定。

研究讨论

1. 受精过程的两个关键阶段：本研究确定了在 CD9 介导的微绒毛延伸之后，配子融合存在两个不同阶段。第一阶段是卵母细胞触手的形成，IZUMO1 - JUNO 复合物在此过程中起关键作用；第二阶段是 SEAL 的形成，其特征是卵母细胞表面内陷包裹精子，且不形成吞噬体。精子膜蛋白 DCST1、DCST2、SPACA6、TMEM95、FIMP 和 TMEM81 对 SEAL 的形成至关重要，在此阶段 JUNO 从卵膜消散。
2. 卵母细胞触手形成机制：在 K562 细胞中，表达 IZUMO1 的细胞与表达 JUNO 的细胞相遇时，几乎完全重建了卵母细胞触手的形成，这表明 IZUMO1 - JUNO 相互作用足以驱动这种膜变形。CD9 与膜突起相关，它可能通过感知和聚集在膜曲率区域，促进微绒毛的形成和伸长，同时 IZUMO1 - JUNO^trans复合物的形成可能产生机械力，引发膜的动态变形。
3. SEAL 形成的复杂性：SEAL 的形成是一个复杂的过程，与膜融合在时空上紧密相关。上述精子蛋白中的任何一种缺失都会导致停滞在卵母细胞触手阶段，但它们是否直接参与 SEAL 的形成尚不清楚。SPACA6 - TMEM81 复合物与 IZUMO1 形成的复合物，可能是从卵母细胞触手阶段到 SEAL 阶段的过渡复合物。这些蛋白可能协同作用于膜融合，而非按顺序发挥功能。
4. SEAL 与吞噬作用的区别：吞噬作用是细胞摄取大颗粒（>0.5μm）的过程，小鼠精子头（~7μm）符合吞噬的大小范围。然而，在 SEAL 过程中，使用溶酶体介导的酸化抑制剂巴氟霉素 A1（BafA1）的研究表明，酸化对配子融合没有贡献，且精子被包裹的结构是否完全密封尚不清楚。SEAL 主要功能是吞噬精子，增加配子膜的接触面积并缩短距离，与传统吞噬作用有所不同。
5. JUNO 的作用及消散机制：JUNO 在膜融合前富集在覆盖精子的膜上，但在 SEAL 形成后迅速消散。其消散机制可能是 JUNO 聚集激活了特定的酶，如糖基磷脂酰肌醇（GPI）特异性磷脂酶，使其从 GPI 锚定中释放可溶性多肽。同时，JUNO 的减少和 SEAL 的形成同步发生，可能有助于抑制多精受精。
6. 肌动蛋白在受精过程中的作用：研究数据表明，肌动蛋白动力学在卵母细胞触手形成中可能起着关键作用，精子与卵膜结合时会引发肌动蛋白重排。对于 JUNO 的聚集，可能存在微绒毛富集模型和被动富集模型两种解释。有趣的是，在 SEAL 形成部位未检测到聚合的肌动蛋白。

研究局限性

1. SEAL 的定义及 JUNO 定位分析：SEAL 是通过 FE - SEM 和 CLEM 观察定义的，而非免疫 SEM，因此 JUNO 的定位分析是在光学显微镜分辨率下进行的，分辨率相对有限。
2. 配子融合监测方法的局限性：使用 Hoechst 33342 染料转移方法监测配子融合时，由于染料扩散存在 45 - 90 秒的延迟，在确定定义步骤的精确顺序时存在一定的模糊性。

研究意义

本研究首次发现非经典吞噬样过程 SEAL 是哺乳动物受精的先决条件，明确了关键蛋白在受精过程中不同表面反应中的作用，为深入理解哺乳动物受精的分子机制奠定了基础。未来的研究将进一步阐明每个步骤详细的分子机制，有望为生殖医学领域带来新的突破，为解决不孕不育等相关问题提供理论支持。