基于USP4/SOX9通路探讨吴茱萸碱抑制结直肠癌干细胞特性的分子机制

《Discover Oncology》：Evodiamine inhibits colorectal cancer cell stemness by disturbing ubiquitin specific protease 4 mediated SOX9 stabilization

编辑推荐：结直肠癌(CRC)干细胞特性是导致治疗耐药的关键因素。桂林医学院团队发现去泛素化酶USP4通过稳定SOX9蛋白促进CRC干细胞特性，而中药活性成分吴茱萸碱(EVO)可破坏USP4介导的SOX9去泛素化，显著抑制OCT4、CD133等干性标志物表达。该研究为靶向USP4/SOX9轴开发新型CRC治疗策略提供理论依据，发表于《Discover Oncology》。

　　

结直肠癌(CRC)作为全球发病率第三、死亡率第二的恶性肿瘤，其治疗面临的最大挑战是癌症干细胞(CSCs)介导的转移和耐药。近年来，去泛素化酶(Deubiquitinating enzymes, DUBs)在肿瘤干性调控中的作用备受关注，其中泛素特异性蛋白酶4(USP4)被报道在多种癌症中通过稳定关键蛋白促进肿瘤进展，但其在CRC干细胞特性中的具体机制尚未阐明。与此同时，传统中药吴茱萸的主要活性成分吴茱萸碱(EVO)虽显示出广谱抗肿瘤活性，但其是否通过调控USP4影响CRC干性仍属未知。针对这一科学问题，桂林医学院联合日本德岛大学的研究团队在《Discover Oncology》发表研究，揭示了USP4/SOX9轴在CRC干性调控中的核心作用及EVO的干预机制。

研究采用免疫组化、Western blot(WB)等技术检测临床样本和细胞系中USP4表达；通过Transwell实验和肿瘤球形成实验评估细胞迁移侵袭能力与干性特征；结合环己酰亚胺(CHX)追踪、免疫共沉淀(Co-IP)和泛素化实验解析USP4对SOX9蛋白稳定性的调控机制；最后采用剂量梯度实验验证EVO对USP4/SOX9通路的抑制作用。

3.1 USP4在CRC中高表达并促进肿瘤迁移
通过20对CRC组织检测发现，USP4在癌组织中表达显著高于癌旁组织。SW480和HCT116细胞中USP4及干性相关转录因子SOX9表达均高于正常结肠上皮细胞NCM460。过表达USP4可增强CRC细胞迁移侵袭能力，而敲低USP4则产生相反效果。

3.2 USP4通过SOX9促进CRC干性
USP4过表达显著上调SOX9、OCT4和CD133蛋白水平，沉默USP4则降低这些标志物表达。救援实验证实，在USP4过表达细胞中敲除SOX9可逆转OCT4/CD133上调和肿瘤球形成能力，表明SOX9是USP4调控干性的关键下游效应分子。

3.3 USP4介导SOX9去泛素化稳定
USP4不影响SOX9 mRNA水平，但蛋白酶体抑制剂MG132可挽救USP4敲低导致的SOX9降解。CHX实验显示USP4延长SOX9蛋白半衰期。Co-IP证实两者直接结合，且USP4能显著降低SOX9泛素化修饰水平，证实USP4通过去泛素化维持SOX9稳定性。

3.4 EVO通过破坏USP4-SOX9轴抑制干性
EVO以剂量依赖性方式降低USP4、SOX9、OCT4和CD133表达。CHX实验显示EVO加速SOX9降解，而MG132处理可逆转EVO对SOX9的抑制作用，表明EVO通过促进USP4降解间接 destabilize SOX9。

该研究首次阐明USP4通过去泛素化SOX9维持CRC干细胞特性的分子机制，并揭示EVO靶向该通路的治疗潜力。从转化医学角度看，开发EVO衍生物或USP4特异性抑制剂有望成为克服CRC耐药的新策略。研究不仅为CRC干性调控提供了新靶点，也为中药活性成分的现代化研究提供了范式。值得注意的是，USP4在多种癌症中具有上下文依赖性功能，未来需进一步探索其组织特异性调控网络以优化靶向治疗方案。