克隆扩增主导单细胞线粒体谱系追踪效能：解锁细胞命运密码的新征程

《Genome Biology》：Clonal expansion dictates the efficacy of mitochondrial lineage tracing in single cells

为解决线粒体 DNA（mtDNA）变异作为可靠谱系标记的效能受其复杂动态影响的问题，研究人员开展了线粒体谱系追踪研究。通过模拟和实验，发现克隆扩增程度影响线粒体谱系追踪效能，还提出谱系信息评分（LIS）。这为线粒体谱系追踪应用提供了重要指导。

　　在生命科学的微观世界里，细胞就像一个个神秘的小宇宙，而线粒体则是其中至关重要的 “能量工厂”。线粒体 DNA（mtDNA）突变自然发生且随细胞分裂积累，本有望成为追踪人类细胞谱系的 “天然条形码”。核基因组突变作为谱系追踪标记时，mtDNA 突变因产生速率比核基因组突变高 10 - 100 倍，在重建细胞谱系上可能具有更高分辨率 。然而，现实却给科学家们出了难题。线粒体在细胞分裂过程中的复杂复制机制，如线粒体瓶颈（在卵子发生和胚胎发生过程中，有效线粒体含量急剧减少的过程）和随机分离，使得 mtDNA 突变难以稳定地作为克隆谱系标记。此外，在单细胞水平检测低频 mtDNA 突变技术上也困难重重，这让 mtDNA 突变用于谱系追踪的可靠性大打折扣。因此，系统研究不同生物学场景下真正的克隆 mtDNA 突变迫在眉睫。

为了解开这个谜团，中国科学院深圳先进技术研究院、厦门大学、中山大学等科研机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Genome Biology》上，为线粒体谱系追踪领域带来了新的曙光。

研究人员主要采用了计算模拟和单细胞基因组学技术。在计算模拟方面，利用 Gillespie 算法模拟细胞分裂历史和线粒体基因组复制过程，设定不同参数来模拟线粒体瓶颈、不同的克隆扩增强度等情况。单细胞基因组学技术则用于获取真实的单细胞数据，包括从外周血单核细胞（PBMC）样本、T 细胞样本等进行单细胞测序，分析 mtDNA 突变情况 。

研究结果主要包含以下几个方面：

1. mtDNA 突变动态的计算模拟：研究人员开发了一个计算框架来模拟线粒体基因组在细胞分裂中的复制和随机分离。在模拟中，初始细胞的线粒体基因组设定有预先存在的突变，且突变率设定为每复制每碱基对μ=5×10?8 。通过设定不同的模型，如线粒体拷贝数保持恒定的恒定模型和线粒体拷贝数先下降后恢复的瓶颈模型，来研究线粒体瓶颈对 mtDNA 突变动态的影响。当细胞群体达到一定数量后，对部分细胞进行弱扩张（τ=0.1 ）和强扩张（τ=0.9 ）处理。结果发现，随着模拟进行，可检测到的预先存在的突变数量逐渐减少，而新产生的突变数量逐渐积累。
2. 谱系信息 mtDNA 变异的起源和效能：亚群特异性变异（SSV）是指在特定细胞亚群中独特存在的变异。研究人员通过模拟数据鉴定 SSV，并评估其追踪真实克隆谱系的效能。在弱扩张模型中，基于 SSV 定义的细胞亚群在真实细胞谱系树中无法聚集，这表明 SSV 在弱扩张情况下难以区分不同细胞谱系；而在强克隆扩张模型中，SSV 定义的细胞亚群呈现出明显的系统发育聚集模式，克隆聚集得分（CAS）也更高，说明 SSV 在强扩张情况下能更有效地追踪细胞谱系。进一步研究发现，弱扩张模型中的 SSV 大多是预先存在的突变，而强克隆扩张模型中部分 SSV 是新产生的突变。
3. 克隆扩张对线粒体谱系追踪的影响：研究人员对不同强度的克隆扩张进行系统比较。在弱扩张模型中，细胞群体由多个弱扩张的细胞群体组成，携带相同 SSV 的细胞克隆身份混杂，无法有效重建克隆结构，通过计算香农熵发现 SSV 定义的亚群克隆多样性高，说明 SSV 在弱扩张模型中效能较低。在强扩张模型中，细胞群体由少数强扩张的克隆主导，SSV 定义的亚群与真实克隆结构一致性更好，克隆多样性更低，表明 SSV 在强扩张模型中效能较高。研究人员还利用来自结直肠癌（CRC）患者的 T 细胞和造血干细胞和祖细胞（HSPCs）的真实单细胞数据集验证了这一结论。在 T 细胞数据集中，将 T 细胞分为强扩张和弱扩张亚群，发现弱扩张 T 细胞中的 SSV 无法重建克隆关系，而强扩张 T 细胞中的 SSV 能更好地标记 T 细胞受体（TCR）克隆。在 HSPCs 数据集中，对来自健康供体的 HSPCs 进行培养和单细胞测序，发现强扩张的 HSPC 集落中 SSV 定义的亚群与先验集落信息一致，克隆多样性低。
4. 谱系信息评分（LIS）助力线粒体谱系追踪应用：由于大多数 mtDNA 变异在细胞内是异质性的，研究人员定义了谱系信息评分（LIS）来量化用于谱系追踪的信息性 mtDNA 突变。LIS 的计算公式为LIS=1+Var(VAF)Mean(VAF)? ，其中Mean(VAF)和Var(VAF)分别表示检测到变异的细胞中变异等位基因频率（VAF）的平均值和方差。通过模拟数据构建精度 - 截断值曲线，发现将 LIS 截断值设定为约 0.6 时，能在模拟数据中达到 80% 的精度率。研究人员将 LIS 应用于不同的单细胞基因组学数据集，包括年轻和老年供体的 PBMC 样本以及自身免疫性疾病患者的 T 细胞样本。在年轻供体的 PBMC 样本中，由于克隆扩增程度低，很少有 SSV 超过 LIS 截断值；而在老年供体的 PBMC 样本中，更多的 SSV 具有较高的 LIS 值，且这些高 LIS 的 SSV 定义的细胞亚群具有更偏向的细胞类型组成，细胞在染色质可及性上关系更紧密，表明它们可能来自共同的祖细胞。在自身免疫性疾病患者的 T 细胞样本中，高 LIS 的 SSV 与 TCR 定义的亚群具有较高的一致性，说明高 LIS 的 SSV 可用于识别真实的克隆。

研究结论表明，与核生殖系突变不同，许多 mtDNA 变异是预先存在的，但仍保留追踪克隆关系的能力。线粒体谱系追踪的效能高度依赖于生物学背景，在严格的克隆扩张场景下表现更好。谱系信息评分（LIS）为评估 mtDNA 变异的谱系追踪效能提供了可靠的指标。该研究加深了人们对 mtDNA 变异体细胞动态的理解，为线粒体谱系追踪的应用提供了实用指导，有助于科学家们更好地探索细胞的奥秘，在肿瘤复发机制研究、免疫系统疾病研究等方面具有重要的潜在应用价值，有望推动生命科学和医学领域的进一步发展。