双亮氨酸拉链激酶（DLK）通过调控巢蛋白（nestin）磷酸化参与视黄酸诱导的Neuro-2a细胞神经元分化

《BMC Molecular and Cell Biology》：Quantitative phosphoproteomics reveals that nestin is a downstream target of dual leucine zipper kinase during retinoic acid-induced neuronal differentiation of Neuro-2a cells

本研究针对神经发育和再生中双亮氨酸拉链激酶（DLK）调控神经突生长的分子机制尚不明确的问题，通过构建DLK稳定敲低的Neuro-2a细胞模型，结合定量磷酸化蛋白质组学（iTRAQ）和靶向质谱（PRM）技术，发现DLK通过调控中间丝蛋白巢蛋白（nestin）的磷酸化及表达水平影响神经元分化，但独立于神经突生长功能。该研究揭示了DLK-nestin轴在神经分化中的新作用，为神经再生研究提供了新靶点。

　　

神经元分化是神经系统发育和再生的核心过程，而神经突的延伸与分支是这一过程的关键形态学标志。双亮氨酸拉链激酶（DLK）作为c-Jun N末端激酶（JNK）通路的上游调控因子，在神经突生长和轴突再生中发挥双重作用，但其下游效应分子网络仍存在大量空白。尤其令人困惑的是，DLK如何通过磷酸化级联反应协调细胞骨架重塑与基因表达调控？这一问题的解答对理解神经损伤修复的分子机制至关重要。

来自加拿大拉瓦尔大学的研究团队以小鼠Neuro-2a神经母细胞瘤细胞为模型，通过稳定敲低DLK并结合视黄酸（RA）诱导分化，首次系统描绘了DLK依赖的磷酸化蛋白质组图谱。研究发现发表于《BMC Molecular and Cell Biology》，揭示了巢蛋白（nestin）作为DLK信号新靶点的意外角色。

研究采用四项关键技术：1）构建两种shRNA介导的DLK稳定敲低细胞系；2）iTRAQ标记结合TiO₂富集的定量磷酸化蛋白质组学分析；3）平行反应监测（PRM）靶向验证关键磷酸化位点；4）活细胞动态成像（IncuCyte? S3）量化神经突生长。

主要研究结果：?

1. ?DLK敲低损害神经突生长
   通过shDLK#1/#2构建的稳定细胞系显示DLK蛋白水平下降50-75%，并显著抑制RA诱导的JNK/c-Jun磷酸化激活。IncuCyte?动态监测证实DLK缺失导致神经突长度和数量减少，其中shDLK#2表型更显著。

2. ?磷酸化蛋白质组筛选鉴定32个差异磷酸肽
   iTRAQ分析发现27个磷酸蛋白（23个下调/9个上调），包括已知的DLK效应分子c-Jun（Ser⁶³/Ser⁷³）和神经细胞黏附分子NCAM1（Ser⁷⁷⁴）。GO分析显示这些蛋白富集于神经系统发育相关通路。

3. ?nestin是DLK调控的新靶点
   PRM验证nestin两个磷酸化位点（Ser⁸⁹⁴/Ser¹⁸³⁷）在DLK敲低后显著降低。RT-qPCR和Western blot证实这种变化源于nestin转录和蛋白水平的整体下降，而非单纯磷酸化修饰减少。

4. ?nestin不直接介导神经突生长
   虽然nestin表达受DLK调控，但siRNA敲低实验显示其缺失不影响RA诱导的神经突延伸。过表达nestin亦不能挽救DLK敲低导致的神经突缺陷，表明DLK促神经突生长依赖其他效应通路。

结论与意义：?
该研究通过多组学整合策略，首次将中间丝蛋白nestin纳入DLK信号网络，证明其是RA诱导神经元分化中的下游靶点，但独立于DLK的神经突生长功能。这一发现拓展了对DLK多功能性的认知：在调控神经前体细胞标志物表达（nestin）与促进成熟神经元形态重塑（神经突生长）间存在通路分离。未来研究可深入探索DLK如何通过不同效应分子协调神经发生的阶段性进程，为神经退行性疾病和损伤修复提供精准干预靶点。