1,25(OH)2D3调控结直肠癌中 DKK1 甲基化的关键作用及潜在机制研究

《Clinical Epigenetics》：The effect of 1,25(OH)2D3 on Dickkopf-1 methylation in colorectal cancer

结直肠癌（CRC）发病率和死亡率高，维生素 D 对其有保护作用，但 1,25 (OH)2D3能否通过调节 DKK1 甲基化影响其表达尚不明确。吉林大学中日联谊医院研究人员开展相关研究，发现 1,25 (OH)2D3可诱导 DKK1 表达，或为 CRC 防治提供新方向。

　　在全球范围内，癌症始终是威胁人类健康的重大难题，其中结直肠癌（Colorectal cancer，CRC）更是不容忽视。它是全球第三大常见恶性肿瘤，死亡率在恶性肿瘤中位居第二。大量研究表明，维生素 D 作为一种脂溶性维生素，对结直肠癌有着重要的保护作用。维生素 D 缺乏与结直肠癌的发病率和死亡率上升密切相关，而激活的 Wnt/β-catenin 信号通路在结直肠癌的发病和进展过程中起着关键作用。1,25 (OH)₂D₃作为维生素 D 的活性形式，能够抑制结肠癌细胞的增殖、促进其分化，还能降低 Wnt 靶基因的水平，在预防结直肠癌发生中意义重大。

Dickkopf-1（DKK1）是 Wnt/β-catenin 信号通路的分泌性拮抗剂，可被 1,25 (OH)₂D₃诱导表达。此前有研究发现，饮食中维生素 D 的摄入与 DKK1 甲基化呈负相关，但由于 DKK1 启动子区域缺乏维生素 D 反应元件序列，维生素 D 调节 DKK1 表达的具体机制尚不清楚。此外，DNA 甲基化作为一种重要的表观遗传机制，在基因表达调控中发挥着关键作用，可在不改变 DNA 序列的情况下，通过影响染色质结构和 DNA 稳定性来调控基因表达。虽然已有研究表明维生素 D 与 DNA 甲基化变化存在关联，但 1,25 (OH)₂D₃能否通过调节 DNA 甲基化影响结直肠癌中 DKK1 的表达，仍是一个未解之谜。

为了解开这些谜团，吉林大学中日联谊医院的研究人员开展了一项深入研究。研究结果表明，DKK1 在结直肠癌中发挥着肿瘤抑制作用，1,25 (OH)₂D₃可以通过诱导 DKK1 启动子和 5’非翻译区（5’UTR）的去甲基化，上调 DKK1 的表达。这一发现为结直肠癌的防治提供了新的潜在方向，具有重要的理论和临床意义。该研究成果发表在《Clinical Epigenetics》杂志上。

在研究过程中，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是通过招募 57 例 CRC 患者和 55 例健康对照，收集其临床资料、组织及血液样本，为后续研究提供样本基础；二是采用酶联免疫吸附试验（ELISA）和液相色谱 - 串联质谱法分别检测血清 DKK1 和 25 (OH) D 水平；三是运用 Bisulphite Amplicon Sequencing（BSAS）、甲基化特异性 PCR（MSP）和焦磷酸测序（Pyrosequencing）等技术检测 DKK1 的甲基化状态；四是利用双荧光素酶报告基因实验探究 CpG 岛甲基化对 DKK1 转录活性的影响。

研究结果具体如下：

1. 血清 DKK1 水平与 25 (OH) D 水平的关联：检测发现，CRC 患者血清 DKK1 和 25 (OH) D 水平均显著低于健康对照组。并且，维生素 D 缺乏的 CRC 患者血清 DKK1 水平更低。通过进一步分析，发现血清 DKK1 水平降低与神经浸润和 25 (OH) D 状态密切相关。
2. DKK1 对 CRC 细胞增殖和迁移的影响：将 DKK1 过表达质粒转染到 CRC 细胞中，结果显示，过表达 DKK1 可显著降低 DLD1 和 RKO 细胞的增殖能力，同时降低 DLD1 细胞的伤口愈合率以及 SW480 细胞的迁移能力，表明 DKK1 在体外具有抑制 CRC 细胞增殖和迁移的作用。
3. DKK1 表达与 DNA 甲基化的关系：研究人员通过 BSAS 检测了结直肠癌细胞系和组织中 DKK1 基因的甲基化模式，发现肿瘤组织中多个位于启动子、5’UTR 和外显子 1 区域的 CpG 位点甲基化水平高于相邻正常组织。在细胞系中，DLD1 和 RKO 细胞的 DKK1 基因高甲基化，而 SW480 细胞非甲基化，且 DKK1 表达水平与 DNA 甲基化状态相关。此外，用 5 - 氮杂 - 2’ - 脱氧胞苷（DAC）处理细胞后，DLD1 和 RKO 细胞中 DKK1 表达增加，进一步证实了 DNA 甲基化对 DKK1 表达的调控作用。
4. 1,25(OH)₂D₃对 DKK1 表达和甲基化的影响：用 100 nM 1,25 (OH)₂D₃处理 SW480、DLD1 和 RKO 细胞 48 小时后，发现 1,25 (OH)₂D₃可诱导这些细胞中 DKK1 mRNA 表达增加。焦磷酸测序结果显示，1,25 (OH)₂D₃处理后，DKK1 启动子和 5’UTR 区域部分 CpG 位点的甲基化率降低。双荧光素酶报告基因实验进一步证实，CpG 岛甲基化会抑制 DKK1 转录活性。

研究结论和讨论部分指出，DKK1 在结直肠癌中发挥着肿瘤抑制基因的作用，其在 CRC 患者中的表达显著低于健康对照组。1,25 (OH)₂D₃能够通过诱导 DKK1 启动子和 5’UTR 的去甲基化上调其表达，这一发现进一步支持了维生素 D 在调节结直肠癌 DNA 甲基化中的作用。同时，研究还发现 1,25 (OH)₂D₃可能通过其他机制调节 DKK1 表达，这为后续研究提供了新的方向。此外，维持足够的血液循环维生素 D 水平对预防和治疗结直肠癌可能具有重要意义，为临床防治结直肠癌提供了新的理论依据和潜在靶点。