从早期光合细菌橙色绿屈挠菌中解析 F1FO型 ATP 合酶结构：开启质子转运机制新认知

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Structure of ATP synthase from an early photosynthetic bacterium Chloroflexus aurantiacus

本文聚焦 F 型 ATP 合酶（F1FO），通过解析橙色绿屈挠菌（Chloroflexus aurantiacus）的 F1FO（CaF1FO）结构，发现其独特的双外周柄和双 a 亚基结构，为理解 ATP 合酶质子转运机制及功能调控提供了新视角，值得一读。

　　### 研究背景
F 型 ATP 合酶（F₁F_O）在氧化磷酸化和光磷酸化的最终步骤中，催化由质子动力势（PMF）驱动的 ATP 合成，广泛存在于线粒体（mtF₁F_O）、叶绿体（cF₁F_O）和细菌（bF₁F_O）中。它由可溶的 F₁部分和膜嵌入的 F_O部分组成，F₁负责合成 ATP，F_O负责质子跨膜转运。在 ATP 合成过程中，PMF 驱动 F_O中 c 环旋转，通过中央轴传递，引起 F₁中 α₃β₃的构象变化，从而实现 ATP 的合成 ，形成一个高效的分子涡轮，利用旋转催化进行能量转换。

光合生物或细胞器中的 F₁F_O合酶，为适应光波动和光依赖的生物能量需求带来的快速 PMF 变化，对 c 亚基和 γ 亚基进行了修饰 。例如，植物和蓝藻的 F₁F_O合酶 c 环化学计量数较大，在 13 - 15 之间，产生较高的 H⁺与 ATP 的比率（H⁺-to-ATP ratio），这有利于维持 PMF 在一个既能支持 ATP 合成又能最小化光损伤的范围内。此外，cF₁F_O可通过 γ 亚基中一个约 40 个氨基酸插入形成的二硫键的氧化还原调节来调控自身活性，而蓝藻的 F₁F_O虽在 γ 亚基有插入，但缺乏这种氧化还原调节，这表明光合 F₁F_O合酶存在多样化的调控机制。由于 F₁F_O合酶在光驱动 ATP 生产中的核心作用，它成为调节光合作用、光转换效率的有吸引力的靶点，在工程植物、合成细胞器或光驱动仿生系统中具有重要应用潜力。

虽然菠菜 cF₁F_O的完整结构已被高分辨率解析，为理解高等植物光合 F₁F_O的结构和机制细节提供了重要信息，但目前尚无光合细菌完整 F₁F_O的高分辨率结构。橙色绿屈挠菌（Chloroflexus aurantiacus）是丝状无氧光合细菌，属于光合生物最早分支的绿屈挠菌门，其通过独特的光依赖电子传递链进行无氧光合作用，最终将电子和质子释放到周质中，产生 ATP 合成所需的 PMF。因此，解析橙色绿屈挠菌的 F₁F_O（CaF₁F_O）结构，有助于深入了解早期光合生物中 F₁F_O的结构和催化机制。

实验方法

1. CaF₁F_O的分离与纯化：培养橙色绿屈挠菌 J - 10 - fl 细胞，经离心、匀浆、多次超速离心获取细胞膜。用n- 十二烷基 -β - D - 麦芽糖吡喃糖苷（DDM）溶解细胞膜，再通过阴离子交换色谱和尺寸排阻色谱进行纯化，得到用于后续实验的CaF₁F_O。
2. 冷冻电镜样品制备与数据收集：测定纯化的CaF₁F_O蛋白浓度后，将其滴加到特制的网格上，经过 blotting、冷冻处理。对于 ADP 结合构象的样品，需先将纯化的CaF₁F_O与 MgCl₂和 ADP 孵育。使用 300 - kV Titan Krios 显微镜结合相关设备和软件收集冷冻电镜图像。
3. 图像处理：运用 CryoSPARC v3.3.2 软件对冷冻电镜图像进行运动校正和对比度传递函数（CTF）估计。对 ADP 自由和 ADP 结合的CaF₁F_O数据集分别进行粒子选择、提取、二维（2D）分类和三维（3D）分类。通过多次迭代的异源精修和非均匀精修，基于金标准傅里叶壳层相关（FSC）截止值 0.143，获得不同旋转状态下的高分辨率三维图，并对 F_O区域和外周柄区域进行聚焦精修，提高局部分辨率。
4. 模型构建与精修：以芽孢杆菌 PS3 的 F₁F_O（PDB ID: 6N2Y）为参考，在 UCSF Chimera 软件中拟合构建 ADP 自由的CaF₁F_O初始模型，然后在 Coot 软件中手动构建原子模型并调整，最后在 PHENIX 软件中进行实空间精修。以 ADP 自由的CaF₁F_O精修模型为参考，在 Coot 软件中手动构建 ADP 结合的CaF₁F_O结构，并在 PHENIX 软件中进行精修。
5. CaF₁F_O重组到蛋白脂质体中：将纯化的CaF₁F_O与磷脂酰胆碱按一定比例混合，添加 Triton X - 100 促进插入，再用 Bio - Beads SM - 2 去除 Triton X - 100，得到重组的CaF₁F_O蛋白脂质体，用于 ATP 合成和水解活性测定。
6. ATP 合成活性测定：利用荧光素酶 - 荧光素系统，通过监测反应产生的荧光强度，根据标准曲线计算 ATP 的生成量，以此测定重组CaF₁F_O蛋白脂质体的 ATP 合成活性。
7. ATP 水解活性测定：将CaF₁F_O催化的 ADP 水解反应与丙酮酸激酶（PK）和乳酸脱氢酶（LDH）偶联，通过监测 NADH 在 340 nm 处的吸光度变化，测定CaF₁F_O的 ATP 水解活性。

实验结果

1. CaF₁F_O的整体结构：从橙色绿屈挠菌中成功分离出具有功能活性的CaF₁F_O，其在蓝色非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）中呈现单一条带，在 tricine - 十二烷基硫酸钠（SDS） - PAGE 中显示八条带。通过肽质量指纹图谱（PMF）鉴定出八个亚基（αβγεδabc），由基因簇（Caur_3040 - 3047）编码。重组到蛋白脂质体中的CaF₁F_O在 ATP 合成方面具有完全活性，但在 ATP 水解方面存在自抑制现象。

通过单颗粒冷冻电镜分析，获得了CaF₁F_O三个不同旋转状态（命名为旋转状态 1、2 和 3）的三维图，分辨率分别为 2.84 ?、2.89 ? 和 3.31 ? 。聚焦精修后，F_O区域和两个外周柄区域的局部分辨率得到进一步提高。在 ADP 自由的结构中，三个 β 亚基均未观察到核苷酸密度，而三个 α 亚基均结合有 ATP 分子；在与 Mg - ADP 孵育后，成功获得了 ADP 结合的 β 亚基结构，分辨率分别为 2.89 ?、2.96 ? 和 3.18 ?，聚焦精修后各区域分辨率再次提升。这些高分辨率的冷冻电镜图使得能够构建精确的原子模型，包括 α、β、γ、ε、a、b、c 亚基以及 δ 亚基的 C 末端结构域（δ - C），其中 δ 亚基的 N 末端结构域（δ - N）在旋转状态 1 中被解析，在状态 2 和 3 中分辨率较低未建模。

CaF₁F_O的结构与以往报道的 ATP 合酶 / ATP 酶不同，它由CaF₁头部（α₃β₃）、膜嵌入的CaF_O（a₂c₁₀）通过两个外周柄（δ₂b₄）和一个中央柄（γε）连接而成，亚基化学计量数为 α₃β₃γεδ₂a₂b₄c₁₀ 。两个 δ 亚基的同型二聚体在CaF₁头部的两个位置（相隔约 135°）连接 b1 - 和 b3 - 亚基与 α₃β₃六聚体，外周柄的卷曲螺旋 b1b2 和 b3b4 分别分叉并锚定一个 a 亚基，形成酶的定子，中央柄（γε）插入CaF₁头部并连接到 c₁₀环作为转子。
2. 柄的构象可塑性：CaF₁F_O的三个旋转状态通过中央柄和 c₁₀环约 120°、125° 和 114° 的旋转来区分。中央柄的旋转诱导CaF₁头部的顺序构象变化，并使其相对于CaF_O对称轴倾斜，即 “进动” 过程。三个旋转状态下，CaF₁和CaF_O对称轴之间的进动角分别为 2.2°、0.3° 和 0.8°，c 亚基位置在旋转状态 2 相对于状态 1 和 3 偏移约 9.3°。中央柄在三个旋转状态下的均方根偏差（RMSD）值表明，γ 和 ε 亚基具有结构刚性，这与 bF₁F_O和 cF₁F_O相似，但与具有两个外周柄的TtV₁V_O和 mtF₁F_O不同，后两者在 c 环旋转时中央柄存在较大灵活性。

CaF₁F_O含有连接两个外周柄到CaF₁头部的 δ 亚基二聚体，每个 δ 亚基由两个通过柔性铰链连接的结构域组成。δ - N 结构域由四个 α 螺旋组成，与以往报道的 δ - N 结构无结构相似性，两个 δ - N 结构域在 δH1 和 δH3 螺旋处互锁形成二聚体，位于CaF₁头部中央。在三个旋转状态转换过程中，δ - N 二聚体的位置分别移动约 16 ?、2 ? 和 14 ?，表明其有助于协调CaF₁进动过程中的构象变化。δ - C 结构域含有四链 β - 折叠和两个 α 螺旋，通过广泛的氢键与 α 亚基的 N 末端 β - 桶相互作用，并容纳 b1 - 和 b3 - 亚基的弯曲 C 末端。在三个旋转状态转换时，α - Ns 向不同方向扭转，但始终与两个 δ - C 保持接触，其中只有 δ2 - C 构象变化最小。在外周柄的中间卷曲螺旋区域，b1b2 - 亚基弯曲成不同曲率，b3b4 - 亚基通过盐桥与 α 亚基紧密接触。在三个旋转状态下，外周柄锚定 a 亚基的膜区域无构象变化。这些结果表明，两个外周柄在三个旋转状态转换过程中，在顶部 δ 亚基二聚体和中间卷曲螺旋区域具有构象可塑性，为CaF₁进动与CaF_O中 c₁₀环旋转的耦合提供了结构稳定性和构象灵活性。
3. Mg - ADP 诱导的CaF₁构象变化和 ε 抑制：CaF₁由三个围绕中央柄的构象不同的 αβ 异源二聚体组成，每个 α 和 β 亚基包含 N 末端 β - 桶结构域、中央核苷酸结合结构域和 C 末端螺旋结构域，α 亚基比 β 亚基多一个 N 末端螺旋（N - helix），部分 N - helix 与 b3b4 - 亚基通过疏水相互作用结合，防止外周柄随机移动。在 ADP 自由和 ADP 结合的结构中，三个 α 亚基均结合 Mg - ATP 且构象相同，ADP 自由结构中三个催化 β 亚基无核苷酸，ADP 结合结构中三个 β 亚基分别呈现 “开放”（β_E，空）、“关闭”（β_TP，Mg - ADP 结合）和 “开放”（β_DP，Mg - ADP 和 Pi 结合）的构象，与报道的 F₁F_O合酶类似，且CaF₁F_O的核苷酸结合位点在从细菌到真核生物的 F₁F_O合酶中高度保守。

ADP 结合后，CaF₁F_O的整体构象变化不明显，但 β_E、β_DP和 α_DP的 C 末端螺旋结构域（H12 - 18），尤其是 β_DP和 β_E的 H15 螺旋向核苷酸结合口袋靠近，表明这些区域参与核苷酸结合的协调。在 ADP 结合结构中，β_DP和 β_TP的 H15 螺旋靠近核苷酸结合口袋，支持 ADP 结合诱导 α₃β₃构象变化从而影响 ATP 合成的观点，其中催化 β 亚基的 H15 螺旋变化尤为明显。

CaF₁F_O的 ADP 自由和 ADP 结合形式均含有延伸的 ε 亚基 C 末端螺旋（εCTD），其插入 α_DP和 β_DP界面并延伸至中央转子腔，与 α_DP和 β_DP形成广泛的疏水相互作用，迫使 β_DP采取开放构象。εCTD 的插入物理性地阻止了 γ 亚基顺时针旋转（即 ATP 水解方向），但允许其逆时针旋转进行 ATP 合成。这与CaF₁F_O的酶活性分析结果一致，即<